A multiplex qPCR TaqMan-assay to detect fungal antagonism between Trichoderma atroviride (Hypocreaceae) and Botrytis cinerea (Sclerotiniaceae) in blackberry fruits using a de novo tef1-α- and an IGS-sequence based probes

Abstract

The aim of this study was to design a Trichoderma atroviride-specific qPCR oligo set, evaluate its specificity, and standardize a methodology that quantifies antagonism against Botrytis cinerea in blackberry fruits (Rubus adenotrichos Schltdl.). Primers and probe were designed based on the nuclear translation elongation factor 1-alpha (tef1-α) of T. atroviride. A commercial IGS-based oligo set was used to quantify B. cinerea. The specificity of the designed oligo set, along with ITS-based oligo sets, was assessed using other Trichoderma species and B. cinerea. Multiplex qPCR assays were performed using DNA from B. cinerea, T. atroviride, and blackberries inoculated with these fungi. Assays with the tef1-α oligo set showed high sensitivity and reproducibility. In inoculated fruits, T. atroviride and B. cinerea were quantified simultaneously, including in symptomless tissues. This work standardized a qPCR methodology that specifically targets a T. atroviride isolate. This newly-designed qPCR oligo set could be useful in future biological control programs.El objetivo de este estudio fue diseñar un conjunto de oligonucleótidos qPCR específicos de Trichoderma atroviride, evaluar su especificidad y estandarizar una metodología que cuantifique el antagonismo contra Botrytis cinerea en frutos de mora (Rubus adenotrichos Schltdl.). Los cebadores y la sonda se diseñaron basándose en el factor de elongación de traducción nuclear 1-alfa (tef1-α) de T. atroviride. Se utilizó un conjunto de oligo comercial basado en IGS para cuantificar B. cinerea. La especificidad del conjunto de oligonucleótidos diseñado, junto con los conjuntos de oligonucleótidos basados ​​en ITS, se evaluó utilizando otras especies de Trichoderma y B. cinerea. Se realizaron ensayos de qPCR multiplex utilizando ADN de B. cinerea, T. atroviride y moras inoculadas con estos hongos. Los ensayos con el conjunto de oligo tef1-α mostraron una alta sensibilidad y reproducibilidad. En frutos inoculados, T. atroviride y B. cinerea se cuantificaron simultáneamente, incluso en tejidos asintomáticos. Este trabajo estandarizó una metodología qPCR que se dirige específicamente a un aislado de T. atroviride. Este conjunto de oligonucleótidos qPCR de nuevo diseño podría ser útil en futuros programas de control biológico.O objetivo deste estudo foi projetar um conjunto de oligo qPCR específico para atrovirida de Trichoderma, avaliar sua especificidade e padronizar uma metodologia que quantifica o antagonismo contra Botrytis cinerea em frutas de amora-preta (Rubus adenotrichos Schltdl.). Os primers e a sonda foram desenhados com base no fator de alongamento da tradução nuclear 1-alfa (tef1-α) de T. atroviride. Um conjunto comercial de oligo baseado em IGS foi usado para quantificar B. cinerea. A especificidade do conjunto de oligo projetado, juntamente com conjuntos de oligo baseados em ITS, foi avaliada usando outras espécies de Trichoderma e B. cinerea. Ensaios de qPCR multiplex foram realizados usando DNA de B. cinerea, T. atroviride e amoras-pretas inoculadas com esses fungos. Os ensaios com o conjunto de oligo tef1-α mostraram alta sensibilidade e reprodutibilidade. Nos frutos inoculados, T. atroviride e B. cinerea foram quantificados simultaneamente, inclusive em tecidos assintomáticos. Este trabalho padronizou uma metodologia qPCR que visa especificamente um isolado de T. atroviride. Este conjunto de oligo qPCR recém-projetado pode ser útil em futuros programas de controle biológico.