Confirmación de la identidad y determinación de la variabilidad genética de aislamientos de Mycobacterium sp. obtenidos durante el diagnóstico de tuberculosis bovina por cultivo, en el SENASA durante los años 2018-2021, Costa Rica

Abstract

La tuberculosis bovina, causada principalmente por Mycobacterium bovis, constituye un desafío sanitario, económico y epidemiológico debido a su impacto en los sistemas ganaderos, su carácter zoonótico y las dificultades asociadas con su control. El cultivo bacteriano continúa siendo el estándar de referencia para la confirmación del agente, aunque presenta limitaciones derivadas del tiempo requerido y la variabilidad en la recuperación del agente infeccioso. Este trabajo integra los resultados del cultivo microbiológico, la confirmación molecular y el análisis genómico para caracterizar la estructura poblacional de cepas circulantes de M. bovis en Costa Rica para los años 2018-2021. Se analizaron 337 solicitudes de cultivo que incluían 894 muestras procesadas entre 2018 y 2021 por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (LANASEVE), con una positividad en cultivo en medio Stonebrink cercana al 35% y con Alajuela como la provincia con mayor número de aislamientos. Para confirmación del agente, se emplearon dos técnicas moleculares: una PCR múltiple basada en regiones de diferencia para discriminar especies del complejo M. tuberculosis, y una qPCR dirigida a los marcadores IS1081 y Locus 3, ambos métodos con alta especificidad y capacidad para confirmar los aislamientos recuperados por cultivo. Con el fin de profundizar en la diversidad genética de M. bovis, se realizó secuenciación del genoma completo (WGS) de 57 aislamientos bovinos y dos de casos humanos. Los resultados evidenciaron la presencia del linaje Europeo 1 según la clasificación clásica de los complejos clonales y se caracterizó la agrupación linaje genético para Costa Rica como Mbovis-07 y sublinaje como Mbovis-07A, revelando una estrecha relación genética entre los aislamientos, con una diversidad intra-linaje inferior a 20 SNP, indicando bajo grado de variación genómica sugiriendo la posible circulación de cepas estrechamente relacionadas. Además, al realizar el análisis in sílico de los genomas se logró obtener los patrones de espoligotipos para todos los genomas y al analizar estos se encontró la presencia de cuatro patrones: SB2020, SB1041, SB1040 y un nuevo patrón no registrado previamente, otorgándose el SB2844. El espoligotipo SB2020 fue el predominante, especialmente en Alajuela y San José, lo que sugiere zonas de transmisión sostenida. Herramientas para espoligoforest como MIRU-VNTRplus y MERCAT revelaron una baja variabilidad genética, evidenciando un linaje dominante en el hato bovino costarricense, del cual derivan microvariantes recientes por pérdida progresiva de espaciadores. El patrón SB1040 se ubicó como genotipo más distante y coincidió con un caso humano potencialmente importado. Los resultados de este trabajo muestran que la integración entre técnicas clásicas y genómicas aporta información clave para la vigilancia epidemiológica, la detección de clústeres de transmisión y la investigación de posibles casos zoonóticos y que es útil combinar el diagnóstico microbiológico y las herramientas moleculares en particular la genómica para complementar el diagnóstico tradicional, apoyar y fortalecer las estrategias de acción y toma de decisiones en el programa nacional para el control y posible erradicación de la tuberculosis bovina en Costa Rica.

Bovine tuberculosis, caused primarily by Mycobacterium bovis, poses a health, economic, and epidemiological challenge due to its impact on livestock systems, its zoonotic nature, and the difficulties associated with its control. Bacterial culture remains the gold standard for confirming the pathogen, although it has limitations due to the time required and variability in the recovery of the infectious agent. This study integrates the results of microbiological culture, molecular confirmation, and genomic analysis to characterize the population structure of circulating strains of M. bovis in Costa Rica for the years 2018–2021. A total of 337 culture requests were analyzed, comprising 894 samples processed between 2018 and 2021 by the National Laboratory of Veterinary Services (LANASEVE), with a culture positivity rate in Stonebrink medium of approximately 35% and Alajuela as the province with the highest number of isolates. To confirm the pathogen, two molecular techniques were used: a multiplex PCR based on regions of difference to distinguish species within the M. tuberculosis complex, and a qPCR targeting the IS1081 and Locus 3 markers, both methods exhibiting high specificity and the ability to confirm isolates recovered by culture. To further investigate the genetic diversity of M. bovis, whole-genome sequencing (WGS) was performed on 57 bovine isolates and two human isolates. The results confirmed the presence of the European 1 lineage according to the classical classification of clonal complexes, and the genetic lineage for Costa Rica was characterized as Mbovis-07, with the sublineage designated Mbovis -07A, revealing a close genetic relationship among the isolates, with intra-lineage diversity of less than 20 SNPs, indicating a low degree of genomic variation and suggesting the possible circulation of closely related strains.In addition, in silico analysis of the genomes revealed spoligotype patterns for all genomes; analysis of these patterns identified the presence of four patterns: SB2020, SB1041, SB1040, and a new, previously unrecorded pattern, designated SB2844. The SB2020 spoligotype was the predominant one, especially in Alajuela and San José, suggesting areas of sustained transmission. Spoligotyping tools such as MIRU-VNTRplus and MERCAT revealed low genetic variability, indicating a dominant lineage in the Costa Rican cattle herd, from which recent microvariants have emerged due to progressive loss of spacers. The SB1040 pattern was identified as the most distantly related genotype and coincided with a potentially imported human case. The results of this study show that the integration of classical and genomic techniques provides key information for epidemiological surveillance, the detection of transmission clusters, and the investigation of potential zoonotic cases; and that it is useful to combine microbiological diagnosis with molecular tools—particularly genomics—to complement traditional diagnosis and to support and strengthen action strategies and decision-making within the national program for the control and potential eradication of bovine tuberculosis in Costa Rica.