R-Ras Glucosylation and transient RhoA activation determine the cytopathic effect produced by Toxin B variants from Toxin A-negative strains of clostridium difficile

Abstract

Clostridium difficile induces antibiotic-associated diarrhea through the production of toxin A and toxin B; the former toxin has been assumed to be responsible for the symptoms of the disease. Several toxin A-negative strains from C. difficile have recently been isolated from clinical cases and have been reported to produce toxin B variants eliciting an atypical cytopathic effect. Ultrastructural analysis indicated these toxins induce a rounding cytopathic effect and filopodia-like structures. Toxin B variants glucosylated R-Ras, and transfection with a constitutively active mutant of this GTPase protected cells against their cytopathic effect. Treatment of cells with toxin B variants induced detachment from the extracellular matrix and blockade of the epidermal growth factor-mediated phosphorylation of extracellular-regulated protein kinases, demonstrating a deleterious effect on the R-Ras-controlled avidity of integrins. Treatment with toxin B variants also induced a transient activation of RhoA probably because of inactivation of Rac1. Altogether, these data indicate that the cytopathic effect induced by toxin B variants is because of cell rounding and detachment mediated by R-Ras glucosylation, and the induction of filopodia-like structures is mediated by RhoA activation. Implications for the pathophysiology of C. difficile-induced diarrhea are discussed.El Clostridium difficile induce la diarrea asociada a los antibióticos mediante la producción de la toxina A y la toxina B; se ha asumido que la primera toxina es la responsable de los síntomas de la enfermedad. Recientemente se han aislado de casos clínicos varias cepas negativas de toxina A de C. difficile y se ha informado de que producen variantes de toxina B que producen un efecto citopático atípico. Los análisis ultraestructurales indicaron que esas toxinas inducen un efecto citopático de redondeo y estructuras similares a las filopodias. Las variantes de la toxina B glucosilada R-Ras, y la transfección con un mutante constitutivamente activo de esta GTPasa protegieron a las células contra su efecto citopático. El tratamiento de las células con variantes de la toxina B indujo el desprendimiento de la matriz extracelular y el bloqueo de la fosforilación mediada por el factor de crecimiento epidérmico de las proteínas cinasas reguladas extracelularmente, lo que demuestra un efecto perjudicial en la avidez de integrinas controlada por R-Ras. El tratamiento con variantes de la toxina B también indujo una activación transitoria de la RhoA, probablemente debido a la inactivación de la Rac1. En conjunto, estos datos indican que el efecto citopático inducido por las variantes de la toxina B se debe al redondeo y desprendimiento de las células mediado por la glucosilación de R-Ras, y la inducción de estructuras similares a filopodios está mediada por la activación de RhoA. Se discuten las implicaciones para la fisiopatología de la diarrea inducida por C. difficile.