In vivo animal models confrm an increased virulence potential and pathogenicity of the NAP1/RT027/ST01 genotype within the Clostridium difcile MLST Clade 2

Abstract

Background: Based on MLST analyses the global population of C. difcile is distributed in eight clades, of which Clade 2 includes the “hypervirulent” NAP1/RT027/ST01 strain along with various unexplored sequence types (STs). Methods: To clarify whether this clinically relevant phenotype is a widespread feature of C. difcile Clade 2, we used the murine ileal loop model to compare the in vivo pro-infammatory (TNF-α, IL-1β, IL-6) and oxidative stress activi‑ ties (MPO) of fve Clade 2 clinical C. difcile isolates from sequence types (STs) 01, 41, 67, and 252. Besides, we infected Golden Syrian hamsters with spores from these strains to determine their lethality, and obtain a histological evalua‑ tion of tissue damage, WBC counts, and serum injury biomarkers (LDH, ALT, AST, albumin, BUN, creatinine, Na+, and Cl−). Genomic distances were calculated using Mash and FastANI to explore whether the responses were dictated by phylogeny. Results: The ST01 isolate tested ranked frst in all assays, as it induced the highest overall levels of pro-infammatory cytokines, MPO activity, epithelial damage, biochemical markers, and mortality measured in both animal models. Statistically indistinguishable or rather similar outputs were obtained for a ST67 isolate in tests such as tissue dam‑ age, neutrophils count, and lethal activity. The results recorded for the two ST41 isolates tested were of intermediate magnitude and the ST252 isolate displayed the lowest pathogenic potential in all animal experiments. This ordering matched the genomic distance of the ST01 isolate to the non-ST01 isolates. Conclusions: Despite their close phylogenic relatedness, our results demonstrate diferences in pathogenicity and virulence levels in Clade 2 C. difcile strains, confrm the high severity of infections caused by the NAP1/RT027/ST01 strain, and highlight the importance of C. difcile typing.

Antecedentes: Según los análisis MLST, la población mundial de C. difcile se distribuye en ocho clados, de los cuales el clado 2 incluye la cepa "hipervirulenta" NAP1/RT027/ST01 junto con varios tipos de secuencia (ST) no explorados. Métodos: Para aclarar si este fenotipo clínicamente relevante es una característica generalizada del clado 2 de C. difcile, utilizamos el modelo de asa ileal murina para comparar las actividades proinflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-6) y de estrés oxidativo (MPO) in vivo de cinco aislados clínicos de C. difcile del clado 2 de los tipos de secuencia (ST) 01, 41, 67 y 252. Además, infectamos hámsters sirios dorados con esporas de estas cepas para determinar su letalidad y obtener una evaluación histológica del daño tisular, recuentos de glóbulos blancos y biomarcadores de lesión sérica (LDH, ALT, AST, albúmina, BUN, creatinina, Na+ y Cl-). Se calcularon las distancias genómicas mediante Mash y FastANI para explorar si las respuestas estaban dictadas por la filogenia. Resultados: El aislado ST01 se clasificó en primer lugar en todos los ensayos, ya que indujo los niveles generales más altos de citoquinas proinflamatorias, actividad MPO, daño epitelial, marcadores bioquímicos y mortalidad medidos en ambos modelos animales. Se obtuvieron resultados estadísticamente indistinguibles o bastante similares para el aislado ST67 en pruebas como el daño tisular, el recuento de neutrófilos y la actividad letal. Los resultados registrados para los dos aislados ST41 probados fueron de magnitud intermedia y el aislado ST252 mostró el menor potencial patógeno en todos los experimentos con animales. Este ordenamiento coincidió con la distancia genómica del aislado ST01 a los aislados no ST01. Conclusiones: A pesar de su estrecho parentesco filogénico, nuestros resultados demuestran las diferencias en los niveles de patogenicidad y virulencia de las cepas del clado 2 de C. difcile, confrman la elevada gravedad de las infecciones causadas por la cepa NAP1/RT027/ST01 y destacan la importancia de la tipificación de C. difcile.