Aislamiento de bacterias resistentes al plomo a partir de suelos contaminados con este metal

Abstract

Se identificaron cepas bacterianas aisladas de un suelo de las instalaciones de la antigua Recuperadora Nacional de Plomo S.A, ubicada en la provincia de San José, distrito de San Francisco de Dos Ríos, y se estudió el potencial de biorremediación de dichas cepas. Se recolectaron muestras de suelo en tres zonas destinadas al almacenaje de baterías de autos, materias primas y secado de escorias procedentes de los procesos de purificación del metal. En las muestras de suelo se realizó la caracterización química, física y se aislaron y purificaron las cepas bacterianas presentes. Se aplicaron pruebas de identificación bacteriana mediante los sistemas BIOLOG y Vitek 2 Compact, posteriormente se realizaron bioensayos para determinar la tolerancia de las cepas identificadas ante la presencia de plomo. Se designaron tres sitios de muestreo con base en diferencias en la coloración y presencia de insumos y residuos propios de la actividad industrial realizada en el lugar. En cada zona se recolectaron de 6 a 8 submuestras entre 0 y 20 cm de profundidad, se mezclaron y se realizó un cuarteo para disminuir el tamaño de la muestra, la cual posteriormente se empleó para los análisis respectivos. Los resultados de los análisis químicos se interpretaron según la tabla propuesta por Molina y Meléndez, 2002, siendo esta una referencia en el país para evaluar la calidad productiva de los suelos. Las tres zonas reportaron valores de pH ligeramente ácidos (5,58±0,01, 5,22±0,01 y 6,05±0,01 respectivamente); los valores de acidez intercambiable fueron de 0,700±0,006, 0,100±0,001 y 0,150±0,001 cmol/L, los cuales se ubicaron en un ámbito bajo para las zonas 2 y 3 (menores a 0,3 cmol/L) y en nivel óptimo (mayor a 0,30 cmol/L) en la zona 1. Con respecto a las bases del suelo (Ca, Mg y K), el Ca en la zona 1 presentó 22,57±0,09cmol/L, siendo este un valor establecido como alto (mayor a 15 cmol/L), mientras que las otras dos zonas mostraron valores de 10,24±0,15 y 14,13±0,20 cmol /L, considerándose éstos como valores ubicados en un ámbito óptimo (6-15 cmol/L). El Mg presentó valores de 2,20±0,05, 3,10±0,01 y 1,80±0,01 cmol/L respectivamente, los cuales se clasifican como valores medios (3-6 cmol/L). Por su parte, el K se cuantificó en concentraciones de 1,34±0,02, 1,24±0,02 y 1,92±0,02cmol/L, valores catalogados como altos (mayores a 0,8 cmol/L). El P, en las zonas 1 y 2, mostró valores de 20,90±0,13 y 31,00±0,39 50 (ámbito óptimo20-50 mg/L), y en la zona 3 la concentración obtenida fue de 60,50±0,74 mg/L, ubicándose dentro del ámbito alto (valores superiores a 50 mg/L). Con respecto a los microelementos, el Cu presentó valores de 9,80±0,12, 14,00±0,29 y 16,00±0,32 mg/L respectivamente, ubicándose los tres valores en el ámbito de óptimos (1-20 mg/L); mientras que el Zn en la zona 1 reportó 10,10±0,13 mg/L y 8,80±0,11 mg/L en la zona 2, ambos valores catalogados como óptimos (3-10 mg/L), y en la zona 3 el valor fue de 14,40±0,18 mg/L, valor definido como alto (mayor a 10 mg/L). El Mn en la zona 1 y 2 se cuantificó en 33.20±0,23 y 20,60±0,21 mg/L, ambos valores óptimos (10-50 mg/L), y en la zona 3 el valor fue de 4,80±0,19 mg/L, siendo este un valor interpretado como bajo (menor a 5 mg/L). Por último, el Fe se estableció como un elemento presente en concentraciones elevadas con valores de 80,00±0,75 en zona 1, 190,0±1,6 en zona 2, y 71,0±0,75 mg/L en zona 3, siendo el ámbito óptimo de 10 a 50 mg/L. Para la materia orgánica se obtuvieron valores de 8,400±0,009 % en zona 2 y 6,450±0,009% en zona 3, por su parte la zona 1 mostró valores bajos de 3,000±0,009%, siendo los valores óptimos propuestos por Molina y Meléndez de 5-10%. La textura mostró que los suelos son francos pese a que se encontraron diferencias en los porcentajes de las partículas, para las zonas 2 y 3, el tipo de suelo es franco arcillo arenoso, mientras que la zona 1 muestra suelo tipo franco arenoso. Con respecto a la concentración total del plomo, la zona1 reportó 54700 mg/kg, siendo este un valor elevado en comparación con otros datos reportados por la literatura, las zonas 2 y 3 mostraron valores de 5048 mg/kg y 23572 mg/kg respectivamente. Para un suelo sin contaminar se reportan valores del metal de15 mg/kg, mientras que la legislación nacional establece 900 mg/kg, como concentración máxima en suelos industriales, lo que permite considerar que se obtuvieron valores elevados de plomo en todos los suelos estudiados. En lo referente al aislamiento e identificación de bacterias, se aislaron 8 cepas con diversidad de morfologías, donde dominaron las colonias de formas circulares e irregulares; en general, todas las cepas mostraron crecimiento lento en el medio extracto de suelo utilizado. Se analizó la capacidad metabólica hacia diferentes fuentes de carbono, obteniéndose la identificación más probable de 6 de las 8 cepas mediante el uso de los sistemas BIOLOG Inc. y Vitek Compact. En la zona 1 se identificaron las cepas Bacillus lentus, Sphingomonas paucimobilis y Bacillus cereus, las tres mediante el sistema Vitek Compact, y en la zona 2, se identificaron las cepas Burkholderia cepacia y Actinomyces con el sistema BIOLOG Inc. y Bacillus sphaericus con el sistema el sistema Vitek Compact. Se determinó la tolerancia al plomo de las bacterias aisladas de la zona 1 (la de mayor concentración de plomo), se utilizó medio mínimo (líquido y en placas) enriquecido con el metal en concentraciones de 250, 500, 750 y 1000 μg Pb/mL. La cepa Bacillus lentus mostró tolerancia a las 4 concentraciones ensayadas, mientras que la cepa Sphingomonas paucimobilis y Bacillus cereus no mostraron crecimiento, por lo que con estas dos cepas se estableció otra prueba de tolerancia con medio enriquecidos con concentraciones menores a 250 μg Pb/mL. Para el caso de S. paucimobilis se obtuvo crecimiento de la bacteria hasta una concentración de 50 μg/mL de Pb, mientras que B. cereus no mostró crecimiento en las placas enriquecidas con Pb, lo que demostró que B. cereus no toleró la presencia del metal. Se investigó la capacidad de tolerancia de B. lentus en medio líquido, enriquecido con 250 μg Pb/mL, en el cual a lo largo de 5 días se obtuvo una tendencia hacia la disminución del Pb soluble. En promedio la reducción de la concentración de Pb soluble de un 27%, con respecto al valor inicial y los controles negativos.Bacterial strains isolated from soil at the facilities of the former Recuperadora Nacional de Plomo S.A, located in the province of San José, district of San Francisco de Dos Ríos, were identified, and the bioremediation potential of these strains was studied. Soil samples were collected in three areas intended for the storage of car batteries, raw materials and dried slag from metal purification processes. In the soil samples, the chemical and physical characterization was carried out and the bacterial strains present were isolated and purified. Bacterial identification tests were applied using the BIOLOG and Vitek 2 Compact systems, later bioassays were performed to determine the tolerance of the identified strains in the presence of lead. Three sampling sites were designated based on differences in color and presence of inputs and waste typical of the industrial activity carried out in the place. In each zone, 6 to 8 subsamples between 0 and 20 cm depth were collected, mixed and quartered to reduce the size of the sample, which was later used for the respective analyses. The results of the chemical analyzes were interpreted according to the table proposed by Molina and Meléndez, 2002, this being a reference in the country to evaluate the productive quality of soils. The three zones reported slightly acidic pH values ​​(5.58±0.01, 5.22±0.01 and 6.05±0.01 respectively); The exchangeable acidity values ​​were 0.700±0.006, 0.100±0.001 and 0.150±0.001 cmol/L, which were located in a low range for zones 2 and 3 (less than 0.3 cmol/L) and at an optimal level. (greater than 0.30 cmol/L) in zone 1. Regarding the soil bases (Ca, Mg and K), the Ca in zone 1 presented 22.57±0.09cmol/L, this being a value established as high (greater than 15 cmol/L), while the other two areas showed values ​​of 10.24±0.15 and 14.13±0.20 cmol/L, considering these as values ​​located in an optimal range (6-15 cmol/L). The Mg presented values ​​of 2.20±0.05, 3.10±0.01 and 1.80±0.01 cmol/L respectively, which are classified as mean values ​​(3-6 cmol/L). For its part, K ​​was quantified at concentrations of 1.34±0.02, 1.24±0.02 and 1.92±0.02cmol/L, values ​​classified as high (greater than 0.8 cmol/L ). The P, in zones 1 and 2, showed values ​​of 20.90±0.13 and 31.00±0.39 50 (optimum range 20-50 mg/L), and in zone 3 the concentration obtained was 60 .50±0.74 mg/L, being within the high range (values ​​greater than 50 mg/L). Regarding the microelements, Cu presented values ​​of 9.80±0.12, 14.00±0.29 and 16.00±0.32 mg/L respectively, placing the three values ​​in the optimum range (1 -20mg/L); while Zn in zone 1 reported 10.10±0.13 mg/L and 8.80±0.11 mg/L in zone 2, both values ​​classified as optimal (3-10 mg/L), and in zone 3 the value was 14.40 ± 0.18 mg/L, a value defined as high (greater than 10 mg/L). The Mn in zone 1 and 2 was quantified at 33.20 ± 0.23 and 20.60 ± 0.21 mg/L, both optimal values ​​(10-50 mg/L), and in zone 3 the value was 4. .80±0.19 mg/L, this being a value interpreted as low (less than 5 mg/L). Finally, Fe was established as an element present in high concentrations with values ​​of 80.00±0.75 in zone 1, 190.0±1.6 in zone 2, and 71.0±0.75 mg/L. in zone 3, with the optimum range from 10 to 50 mg/L. For organic matter, values ​​of 8,400 ± 0.009% were obtained in zone 2 and 6,450 ± 0.009% in zone 3, while zone 1 showed low values ​​of 3,000 ± 0.009%, with the optimal values ​​proposed by Molina and Meléndez being 5. -10% The texture showed that the soils are loam despite the fact that differences were found in the percentages of the particles, for zones 2 and 3, the type of soil is sandy clay loam, while zone 1 shows sandy loam type soil. Regarding the total concentration of lead, zone 1 reported 54,700 mg/kg, this being a high value compared to other data reported in the literature, zones 2 and 3 showed values ​​of 5,048 mg/kg and 23,572 mg/kg, respectively. . For an uncontaminated soil, metal values ​​of 15 mg/kg are reported, while national legislation establishes 900 mg/kg as the maximum concentration in industrial soils, which allows us to consider that high lead values ​​were obtained in all the soils studied. Regarding the isolation and identification of bacteria, 8 strains with a diversity of morphologies were isolated, where colonies with circular and irregular shapes dominated; in general, all the strains showed slow growth in the soil extract medium used. The metabolic capacity towards different carbon sources was analyzed, obtaining the most probable identification of 6 of the 8 strains by using the BIOLOG Inc. and Vitek Compact systems. In zone 1, the Bacillus lentus, Sphingomonas paucimobilis and Bacillus cereus strains were identified, all three using the Vitek Compact system, and in zone 2, the Burkholderia cepacia and Actinomyces strains were identified with the BIOLOG Inc. system and Bacillus sphaericus with the system the Vitek Compact system. The tolerance to lead of the bacteria isolated from zone 1 (the one with the highest lead concentration) was determined, a minimum medium (liquid and in plates) enriched with the metal was used in concentrations of 250, 500, 750 and 1000 μg Pb/ mL. The Bacillus lentus strain showed tolerance to the 4 concentrations tested, while the Sphingomonas paucimobilis and Bacillus cereus strains did not show growth, so another tolerance test was established with these two strains with enriched media with concentrations of less than 250 μg Pb/mL. . In the case of S. paucimobilis, growth of the bacteria was obtained up to a concentration of 50 μg/mL of Pb, while B. cereus did not show growth in the plates enriched with Pb, which demonstrated that B. cereus did not tolerate the presence of the metal. The tolerance capacity of B. lentus was investigated in a liquid medium, enriched with 250 μg Pb/mL, in which a trend towards a decrease in soluble Pb was obtained over 5 days. On average, the reduction of the concentration of soluble Pb of 27%, with respect to the initial value and the negative controls.