Cloning, purification and characterization of nigrelysin, a novel actinoporin from the sea anemone Anthopleura nigrescens

Abstract

Actinoporins constitute a unique class of pore-forming toxins found in sea anemones that being secreted as soluble monomers are able to bind and permeabilize membranes leading to cell death. The interest in these proteins has risen due to their high cytotoxicity that can be properly used to design immunotoxins against tumor cells and antigen-releasing systems to cell cytosol. In this work we describe a novel actinoporin produced by Anthopleura nigrescens, an anemone found in the Central American Pacific Ocean. Here we report the amino acid sequence of an actinoporin as deduced from cDNA obtained from total body RNA. The synthetic DNA sequence encoding for one cytolysin variant was expressed in BL21 Star (DE3) Escherichia coli and the protein purified by chromatography on CM Sephadex C-25 with more than 97% homogeneity as verified by MS-MS and HPLC analyses. This actinoporin comprises 179 amino acid residues, consistent with its observed isotope-averaged molecular mass of 19 661 Da. The toxin lacks Cys and readily permeabilizes erythrocytes, as well as L1210 cells. CD spectroscopy revealed that its secondary structure is dominated by beta structure (58.5%) with 5.5% of a-helix, and 35% of random structure. Moreover, binding experiments to lipidic monolayers and to liposomes, as well as per meabilization studies in vesicles, revealed that the affinity of this toxin for sphingomyelin-containing membranes is quite similar to sticholysin II (StII). Comparison by spectroscopic techniques and modeling the three-dimensional structure of nigrelysin (Ng) showed a high homology with StII but several differences were also detectable. Taken together, these results reinforce the notion that Ng is a novel member of the actinoporin pore-forming toxin (PFT) family with a HA as high as that of StII, the most potent actinoporin so far described, but with peculiar structural characteristics contributing to expand the understanding of the structure-function relationship in this protein family.Las actinoporinas constituyen una clase única de toxinas formadoras de poros que se encuentran en las anémonas de mar y que, al ser secretadas como monómeros solubles, pueden unirse y permeabilizar las membranas que conducen a la muerte celular. El interés en estas proteínas ha aumentado debido a su alta citotoxicidad que puede usarse adecuadamente para diseñar inmunotoxinas contra células tumorales y sistemas de liberación de antígenos para el citosol celular. En este trabajo describimos una nueva actinoporina producida por Anthopleura nigrescens, una anémona que se encuentra en el Océano Pacífico centroamericano. Aquí presentamos la secuencia de aminoácidos de una actinoporina deducida del ADNc obtenido del ARN corporal total. La secuencia de ADN sintético que codifica una variante de citolisina se expresó en BL21 Star (DE3) Escherichia coli y la proteína se purificó mediante cromatografía en CM Sephadex C-25 con más del 97% de homogeneidad, como se verificó mediante análisis de MS-MS y HPLC. Esta actinoporina comprende 179 residuos de aminoácidos, de acuerdo con su masa molecular promedio de isótopos observada de 19 661 Da. La toxina carece de Cys y permeabiliza fácilmente los eritrocitos, así como las células L1210. La espectroscopia de CD reveló que su estructura secundaria está dominada por una estructura beta (58,5%) con un 5,5% de hélice a y un 35% de estructura aleatoria. Además, los experimentos de unión a monocapas lipídicas y a los liposomas, así como los estudios de permeabilización en vesículas, revelaron que la afinidad de esta toxina por las membranas que contienen esfingomielina es bastante similar a la esticholisina II (StII). La comparación mediante técnicas espectroscópicas y el modelado de la estructura tridimensional de nigrelysin (Ng) mostró una alta homología con StII, pero también fueron detectables varias diferencias. En conjunto, estos resultados refuerzan la noción de que Ng es un miembro nuevo de la familia de toxinas formadoras de poros de actinoporina (PFT) con un HA tan alto como el de StII, la actinoporina más potente descrita hasta ahora, pero con características estructurales peculiares que contribuyen a ampliar la comprensión de la relación estructura-función en esta familia de proteínas.