New insights into Neutrophil Extracellular Trap (NETs) formation from porcine neutrophils in response to bacterial infections

Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp, Gram negative) and Streptococcus (S.) suis (Gram positive) can cause severe diseases in pigs. During infection, neutrophils infiltrate to counteract these pathogens with phagocytosis and/or neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA-backbone spiked with antimicrobial components. The NET formation mechanisms in porcine neutrophils as a response to both of the pathogens are not entirely clear. The aim of this study was to investigate whether A.pp (serotype 2, C3656/0271/11) and S. suis (serotype 2, strain 10) induce NETs by NADPH oxidase- or CD18-dependent mechanisms and to characterize phenotypes of NETs in porcine neutrophils. Therefore, we investigated NET induction in porcine neutrophils in the presence and absence of NET inhibitors and quantified NETs after 3 h. Furthermore, NETosis and phagocytosis were investigated by transmission electron microscopy after 30 min to characterize different phenotypes. A.pp and S. suis induce NETs that are mainly ROS-dependent. A.pp induces NETs that are partially CD18-dependent. Thirty minutes after infection, both of the pathogens induced a vesicular NET formation with only slight differences. Interestingly, some neutrophils showed only NET-marker positive phagolysosomes, but no NET-marker positive vesicles. Other neutrophils showed vesicular NETs and only NET-marker negative phagolysosomes. In conclusion, both of the pathogens induce ROS-dependent NETs. Vesicular NETosis and phagocytosis occur in parallel in porcine neutrophils in response to S. suis serotype 2 and A.pp serotype 2.Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp, Gram negativo) y Streptococcus (S.) suis (Gram positivo) pueden causar enfermedades graves en los cerdos. Durante la infección, los neutrófilos se infiltran para contrarrestar estos patógenos con la fagocitosis y/o las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Las NETs consisten en un ADN con componentes antimicrobianos. Los mecanismos de formación de NETs en los neutrófilos porcinos como respuesta a ambos patógenos no están del todo claros. El objetivo de este estudio fue investigar si A.pp (serotipo 2, C3656/0271/11) y S. suis (serotipo 2, cepa 10) inducen NETs por mecanismos dependientes de la NADPH oxidasa o de la CD18 y caracterizar los fenotipos de NETs en los neutrófilos porcinos. Por lo tanto, investigamos la inducción de NETs en neutrófilos porcinos en presencia y ausencia de inhibidores de NETs y en el caso de los neutrófilos porcinos. Presencia y ausencia de inhibidores de NET y cuantificamos las NET después de 3 h. Además, se investigó la NETosis y la fagocitosis se investigaron mediante microscopía electrónica de transmisión después de 30 minutos para caracterizar diferentes fenotipos. A.pp y S. suis inducen NETs que son principalmente dependientes de ROS. A.pp induce NETs que son parcialmente dependientes de CD18. Treinta minutos después de la infección, ambos patógenos indujeron la formación de NETs vesiculares con ligeras diferencias. Curiosamente, algunos neutrófilos mostraron sólo fagolisosomas positivos al marcador NET, pero no vesículas positivas al marcador NET. Otros neutrófilos mostraron NETs vesiculares y sólo fagolisosomas negativos al marcador NET. En conclusión, ambos patógenos inducen NETs dependientes de ROS. La NETosis vesicular y la fagocitosis ocurren en paralelo en los neutrófilos porcinos en respuesta a S. suis serotipo 2 y A.pp serotipo 2.