Cinética de la oxidación de los péptidos antimicrobianos catalizada por la lacasa

Abstract

En esta disertación se presenta el estudio sobre la cinética enzimática de oxidación del péptido antimicrobiano TET-124 (KLWWMIRRW), al cual se le incorporó en el N-terminal y C-terminal un residuo de L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina), compuesto fenólico que pueden reaccionar e interaccionar con la superficie de polímeros hidrofóbicos para funcionalización de superficies. Como una posible aplicación en la industria biomédica para funcionalizar las superficies poliméricas de implantes se determinó si los péptidos antimicrobianos TET-124-G-DOPA-G y el G-DOPA-G-TET-124 pueden ser oxidados por la lacasa comercial Trametes versicolor de Sigma Aldrich, mediante el estudio de la cinética de la reacción a través de la calorimetría de titulación isotérmica, técnica altamente sensible que permite estudiar las interacciones biomoleculares de las reacciones enzimáticas de oxidación, ya que relaciona el calor absorbido o liberado durante la titulación calorimétrica con la energía de interacción entre las biomoléculas. Por lo que aplicando modelos matemáticos tales como el modelo Isotérmico de Wiseman y el modelo cinético propuesto por Michaelis-Menten se determinó la Km y la Vmax, además se determinó la entalpía de reacción, la cual es necesaria para aplicar el modelo matemático de Wiseman. El G-DOPA-G-TET-124 presenta una entalpía de - (29,31 ± 0,01) J/mol mientras que el TET-124- G-DOPA-G una entalpía de - (12,56 ± 0,01) J/mol. La oxidación del G-DOPA-G-TET-124 se ve favorecida sobre el TET-124-G-DOPA-G debido a que los procesos de oxidación tienen mayor afinidad a aquel sustrato que tiene una entalpía mayor y más negativa. En cuanto a la cinética de los péptidos, se encontró que la enzima mostró una mayor afinidad hacia el G-DOPA-G-TET-124 ya que la Km de (916,6 ± 0,2) mmol/L es inferior que la del G-DOPA-G-TET-124 (1285,2 ± 0,2) mmol/L, siendo la concentración de sustrato requerida para que la enzima se sature menor para el G-DOPA-G-TET-124. Asimismo, mediante la técnica de ITC se estudió la cinética enzimática de oxidación de dos sustratos, el ABTS y la L-DOPA catalizada por la lacasa. Para el ABTS se determinó además la cinética de oxidación por la técnica UV-Vis y se comparó los parámetros Km y Vmax obtenidos por ambas técnicas, mostrando solamente leves diferencias en los parámetros obtenidos, lo que genera confianza en el uso de la técnica de ITC para determinar la cinética de las reacciones.This dissertation presents the study on the enzymatic kinetics of oxidation of the antimicrobial peptide TET-124 (KLWWMIRRW), to which a residue of L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) was incorporated at the N-terminal and C-terminal. , phenolic compound that can react and interact with the surface of hydrophobic polymers for functionalization of surfaces. As a possible application in the biomedical industry to functionalize the polymeric surfaces of implants, it was determined whether the antimicrobial peptides TET-124-G-DOPA-G and G-DOPA-G-TET-124 can be oxidized by the commercial laccase Trametes versicolor by Sigma Aldrich, by studying the kinetics of the reaction through isothermal titration calorimetry, a highly sensitive technique that allows studying the biomolecular interactions of enzymatic oxidation reactions, since it relates the heat absorbed or released during calorimetric titration with the energy of interaction between biomolecules. Therefore, applying mathematical models such as the Wiseman Isothermal model and the kinetic model proposed by Michaelis-Menten, the Km and Vmax were determined, in addition the reaction enthalpy was determined, which is necessary to apply the Wiseman mathematical model. G-DOPA-G-TET-124 has an enthalpy of - (29.31 ± 0.01) J / mol while TET-124- G-DOPA-G has an enthalpy of - (12.56 ± 0, 01) J / mol. The oxidation of G-DOPA-G-TET-124 is favored over TET-124-G-DOPA-G because the oxidation processes have a higher affinity to that substrate that has a higher and more negative enthalpy. Regarding the kinetics of the peptides, it was found that the enzyme showed a greater affinity towards G-DOPA-G-TET-124 since the Km of (916.6 ± 0.2) mmol / L is lower than the of G-DOPA-G-TET-124 (1285.2 ± 0.2) mmol / L, being the concentration of substrate required for the enzyme to be saturated lower for G-DOPA-G-TET-124. Likewise, using the ITC technique, the enzymatic oxidation kinetics of two substrates, ABTS and L-DOPA catalyzed by laccase, were studied. For the ABTS, the oxidation kinetics were also determined by the UV-Vis technique and the Km and Vmax parameters obtained by both techniques were compared, showing only slight differences in the parameters obtained, which generates confidence in the use of the ITC technique. to determine the kinetics of the reactions.