Brucella-Salmonella lipopolysaccharide chimeras are less permeable to hydrophobic probes and more sensitive to cationic peptides and EDTA than are their native Brucella sp. counterparts

Abstract

A rough (R) Brucella abortus 45/20 mutant was more sensitive to the bactericidal activity of polymyxin B and lactoferricin B than was its smooth (S) counterpart but considerably more resistant than Salmonella montevideo. The outer membrane (OM) and isolated lipopolysaccharide (LPS) of S. montevideo showed a higher affinity for these cationic peptides than did the corresponding B. abortus OM and LPS. We took advantage of the moderate sensitivity of R B. abortus to cationic peptides to construct live R B. abortus-S-LPS chimeras to test the activities of polymyxin B, lactoferricin B, and EDTA. Homogeneous and abundant peripheral distribution of the heterologous S-LPS was observed on the surface of the chimeras, and this coating had no effect on the viability or morphology of the cells. When the heterologous LPS corresponded to the less sensitive bacterium S B. abortus S19, the chimeras were more resistant to cationic peptides; in contrast, when the S-LPS was from the more sensitive bacterium S. montevideo, the chimeras were more susceptible to the action of peptides and EDTA. A direct correlation between the amount of heterologous S-LPS on the surface of chimeric Brucella cells and peptide sensitivity was observed. Whereas the damage produced by polymyxin B in S. montevideo and B. abortus-S. montevideo S-LPS chimeras was manifested mainly as OM blebbing and inner membrane rolling, lactoferricin B caused inner membrane detachment, vacuolization, and the formation of internal electron-dense granules in these cells. Native S and R B. abortus strains were permeable to the hydrophobic probe N-phenyl-1- naphthylamine (NPN). In contrast, only reduced amounts of NPN partitioned into the OMs of the S. montevideo and B. abortus-S. montevideo S-LPS chimeras. Following peptide exposure, accelerated NPN uptake similar to that observed for S. montevideo was detected for the B. abortus-S. montevideo LPS chimeras. The partition of NPN into native or EDTA-, polymyxin B-, or lactoferricin B-treated LPS micelles of S. montevideo or B. abortus mimicked the effects observed with intact cells, and this was confirmed by using micelle hybrids of B. abortus and S. montevideo LPSs. The results showed that LPS is the main cause of B. abortus' resistance to bactericidal cationic peptides, the OM-disturbing action of divalent cationic chelants, and OM permeability to hydrophobic substances. It is proposed that these three features are related to the ability of Brucella bacteria to multiply within phagocytes.

Un mutante 45/20 de Brucella abortus rugoso (R) fue más sensible a la actividad bactericida de la polimixina B y la lactoferricina B que su homólogo liso (S), pero considerablemente más resistente que Salmonella montevideo. La membrana externa (OM) y el lipopolisacárido aislado (LPS) de S. montevideo mostraron una mayor afinidad por estos péptidos catiónicos que la OM y el LPS correspondientes de B. abortus. Aprovechamos la moderada sensibilidad de R B. abortus a los péptidos catiónicos para construir quimeras vivas de R B. abortus-S-LPS para probar las actividades de la polimixina B, la lactoferricina B y el EDTA. Se observó una distribución periférica homogénea y abundante del S-LPS heterólogo en la superficie de las quimeras, y este recubrimiento no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad o la morfología de las células. Cuando el LPS heterólogo correspondía a la bacteria menos sensible S B. abortus S19, las quimeras eran más resistentes a los péptidos catiónicos; en cambio, cuando el S-LPS era de la bacteria más sensible S. montevideo, las quimeras eran más susceptibles a la acción de los péptidos y del EDTA. Se observó una correlación directa entre la cantidad de S-LPS heterólogo en la superficie de las células quiméricas de Brucella y la sensibilidad a los péptidos. Mientras que el daño producido por la polimixina B en las quimeras S-LPS de S. montevideo y B. abortus-S. montevideo se manifestó principalmente como sangrado de la MO y enrollamiento de la membrana interna, la lactoferricina B provocó en estas células el desprendimiento de la membrana interna, la vacuolización y la formación de gránulos internos densos en electrones. Las cepas nativas S y R de B. abortus fueron permeables a la sonda hidrofóbica N-fenil-1-naftilamina (NPN). Por el contrario, sólo cantidades reducidas de NPN se repartieron en los OM de las quimeras S. montevideo y B. abortus-S. montevideo S-LPS. Tras la exposición al péptido, se detectó una absorción acelerada de NPN similar a la observada en S. montevideo en las quimeras LPS de B. abortus-S. montevideo. La partición de NPN en micelas de LPS nativo o tratado con EDTA, polimixina B o lactoferricina B de S. montevideo o B. abortus imitó los efectos observados con células intactas, y esto se confirmó utilizando híbridos de micelas de LPS de B. abortus y S. montevideo. Los resultados mostraron que los LPS son la causa principal de la resistencia de B. abortus a los péptidos catiónicos bactericidas, la acción perturbadora de la MO de los quelantes catiónicos divalentes y la permeabilidad de la MO a las sustancias hidrofóbicas. Se propone que estas tres características están relacionadas con la capacidad de la bacteria Brucella para multiplicarse dentro de los fagocitos.