Characterization of Extracellular Vesicles Secreted by a Clinical Isolate of Naegleria fowleri and Identification of Immunogenic Components within Their Protein Cargo

Abstract

Abstract. Extracellular vesicles (EVs) are small lipid vesicles released by both prokaryotic and eukaryotic cells, involved in intercellular communication, immunomodulation and pathogenesis. In this study, we performed a characterization of the EVs produced by trophozoites of a clinical isolate of the free-living amoeba Naegleria fowleri (N. fowleri). Size distribution, zeta potential, protein profile and protease activity were analyzed. Under our incubation conditions, EVs of different sizes were observed, with a predominant population ranging from 206 to 227 nm. SDS-PAGE revealed protein bands of 25 to 260 KDa. The presence of antigenic proteins was confirmed by Western blot, which evidenced strongest recognition by rat polyclonal antibodies raised against N. fowleri in the region close to 80 KDa and included peptidases, as revealed by zymography. Proteins in selected immunorecognized bands were further identified using nano-ESI-MS/MS. A preliminary proteomic profile of the EVs identified at least 184 proteins as part of the vesicles’ cargo. Protease activity assays, in combination with the use of inhibitors, revealed the predominance of serine proteases. The present characterization uncovers the complexity of EVs produced by N. fowleri, suggesting their potential relevance in the release of virulence factors involved in pathogenicity. Owing to their cargo’s diversity, further research on EVs could reveal new therapeutic targets or biomarkers for developing rapid and accurate diagnostic tools for lethal infections such as the one caused by this amoeba.Resumen. Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas vesículas lipídicas liberadas por células procarióticas y eucariotas, implicadas en la comunicación intercelular, la inmunomodulación y la patogénesis. En este estudio, realizamos una caracterización de los vehículos eléctricos producidos por trofozoítos de un aislado clínico de la ameba de vida libre Naegleria fowleri (N. fowleri). Se analizaron la distribución de tamaños, el potencial zeta, el perfil proteico y la actividad proteasa. En nuestras condiciones de incubación, se observaron vehículos eléctricos de diferentes tamaños, con una población predominante que oscilaba entre 206 y 227 nm. SDS-PAGE reveló bandas de proteínas de 25 a 260 KDa. La presencia de proteínas antigénicas se confirmó mediante Western blot, que evidenció un reconocimiento más fuerte por parte de anticuerpos policlonales de rata generados contra N. fowleri en la región cercana a 80 KDa e incluían peptidasas, como lo reveló la zimografía. Las proteínas en bandas inmunoreconocidas seleccionadas se identificaron adicionalmente utilizando nano-ESI-MS/MS. Un perfil proteómico preliminar de los vehículos eléctricos identificó al menos 184 proteínas como parte de la carga de las vesículas. Los ensayos de actividad de proteasa, en combinación con el uso de inhibidores, revelaron el predominio de serina proteasas. La presente caracterización revela la complejidad de los vehículos eléctricos producidos por N. fowleri, lo que sugiere su posible relevancia en la liberación de factores de virulencia involucrados en la patogenicidad. Debido a la diversidad de su carga, una mayor investigación sobre los vehículos eléctricos podría revelar nuevos objetivos terapéuticos o biomarcadores para desarrollar herramientas de diagnóstico rápidas y precisas para infecciones letales como la causada por esta ameba.