Phenotypes controlled by the Brucella abortus two component system BvrR/BvrS are differentially impacted by BvrR phosphorylation

Abstract

Brucella abortus is a zoonotic pathogen whose virulence depends on its ability to survive intracellularly at the endoplasmic reticulum derived compartment. The two-component system BvrR/BvrS (BvrRS) is essential for intracellular survival due to the transcriptional control of the type IV secretion system VirB and its transcriptional regulator VjbR. It is a master regulator of several traits including membrane homeostasis by controlling gene expression of membrane components, such as Omp25. BvrR phosphorylation is related to DNA binding at target regions, thereby repressing or activating gene transcription. To understand the role of BvrR phosphorylation we generated dominant positive and negative versions of this response regulator, mimicking phosphorylated and non-phosphorylated BvrR states and, in addition to the wild-type version, these variants were introduced in a BvrR negative background. We then characterized BvrRS-controlled phenotypes and assessed the expression of proteins regulated by the system. We found two regulatory patterns exerted by BvrR. The first pattern was represented by resistance to polymyxin and expression of Omp25 (membrane conformation) which were restored to normal levels by the dominant positive and the wild-type version, but not the dominant negative BvrR. The second pattern was represented by intracellular survival and expression of VjbR and VirB (virulence) which were, again, complemented by the wild-type and the dominant positive variants of BvrR but were also significantly restored by complementation with the dominant negative BvrR. These results indicate a differential transcriptional response of the genes controlled to the phosphorylation status of BvrR and suggest that unphosphorylated BvrR binds and impacts the expression of a subset of genes. We confirmed this hypothesis by showing that the dominant negative BvrR did not interact with the omp25 promoter whereas it could interact with vjbR promoter. Furthermore, a global transcriptional analysis revealed that a subset of genes responds to the presence of the dominant negative BvrR. Thus, BvrR possesses diverse strategies to exert transcriptional control on the genes it regulates and, consequently, impacting on the phenotypes controlled by this response regulator.

Brucella abortus es un patógeno zoonótico cuya virulencia depende de su capacidad para sobrevivir intracelularmente en el compartimento derivado del retículo endoplásmico. El sistema de dos componentes BvrR/BvrS (BvrRS) es esencial para la supervivencia intracelular debido al control transcripcional del sistema de secreción de tipo IV VirB y su regulador transcripcional VjbR. Es un regulador maestro de varios rasgos, incluida la homeostasis de la membrana mediante el control de la expresión génica de componentes de la membrana, como Omp25. La fosforilación de BvrR está relacionada con la unión al ADN en regiones diana, reprimiendo o activando así la transcripción génica. Para comprender el papel de la fosforilación de BvrR, generamos versiones dominantes positivas y negativas de este regulador de respuesta, imitando estados fosforilados y no fosforilados de BvrR y, además de la versión de tipo salvaje, estas variantes se introdujeron en un fondo negativo de BvrR. A continuación, caracterizamos los fenotipos controlados por BvrRS y evaluamos la expresión de las proteínas reguladas por el sistema. Encontramos dos patrones reguladores ejercidos por BvrR. El primer patrón estaba representado por la resistencia a la polimixina y la expresión de Omp25 (conformación de la membrana), que fueron restauradas a niveles normales por la versión dominante positiva y la versión de tipo salvaje, pero no por la BvrR dominante negativa. El segundo patrón estaba representado por la supervivencia intracelular y la expresión de VjbR y VirB (virulencia) que, de nuevo, se complementaban con las variantes de tipo salvaje y dominante positivo del BvrR, pero que también se restablecían significativamente mediante la complementación con el BvrR dominante negativo. Estos resultados indican una respuesta transcripcional diferencial de los genes controlados al estado de fosforilación del BvrR y sugieren que el BvrR no fosforilado se une e impacta en la expresión de un subconjunto de genes. Confirmamos esta hipótesis demostrando que el BvrR dominante negativo no interactuaba con el promotor de omp25, mientras que sí podía hacerlo con el promotor de vjbR. Además, un análisis transcripcional global reveló que un subconjunto de genes responde a la presencia del BvrR dominante negativo. Así pues, el BvrR posee diversas estrategias para ejercer control transcripcional sobre los genes que regula y, en consecuencia, incidir en los fenotipos controlados por este regulador de respuesta.