Caracterización de la región promotora del gen omp25 de Brucella abortus.

Abstract

La brucelosis es una enfermedad zoonótica, producida por bacterias del género Brucella. Muchos de los mecanismos que utiliza esta bacteria para invadir y replicarse en las células no se comprenden. Sin embargo, las propiedades de la membrana externa y el sistema de regulación de expresión de genes BvrR/BvrS están ligados a su virulencia. La Omp25 es una de las proteínas de membrana externa más estudiadas. Aunque su función es desconocida, su expresión es regulada por el sistema de regulación BvrR/BvrS que es importante para la virulencia. El objetivo de este trabajo fue la caracterización de la región promotora del gen omp25, como prototipo de secuencias promotoras que constituirían un regulón de virulencia bajo el control de BvrR/BvrS. Para ello, se realizaron fusiones transcripcionales de la región corriente arriba del gen omp25 con el gen reportero lacZ carente de promotor. Una primera fusión contenía 392 pb (pares de bases) corriente arriba de omp25, asimismo, se clonaron dos fragmentos más cortos que contenían 262 pb y 151 pb de la misma región. La expresión de las fusiones transcripcionales en la cepa silvestre Brucella abortus 2308 fue evaluada durante las distintas fases del crecimiento bacteriano. Estos ensayos demostraron la presencia de actividad promotora en dos de los constructos y una notoria disminución de más del 90% en la expresión del gen con el constructo que contenía 151 pb, delimitando la región que posee las secuencias para la activación del promotor. Por lo tanto, existe una actividad promotora basal en las 151 bp corriente arriba de omp25, que es positivamente regulada por secuencias que se encuentran luego de las 152 bp corriente arriba de omp25. Esta caracterización sirve como modelo para realizar estudios comparativos con regiones reguladoras de otros genes importantes para Brucella, crear herramientas que permitan controlar la expresión de éstos y por lo tanto, combatir a este patógeno.

Brucellosis is a zoonotic disease caused by intracellular facultative cocobacili bacteria belonging to the Brucella genus. The mechanisms used to invade and replicate within cells are not well understood. However, its virulence is linked to its outer membrane properties as well as to secretion and gene regulation systems. Omp25 is an outer membrane protein with an unknown function whose gene expression is under the control of the BvrR/BvrS two component regulatory system, relevant for virulence. The aim of this work was to characterize the omp25 promoter region as a prototype of promoter sequences that might constitute a virulence regulon under the BvrR/BvrS control. To accomplish this, transcriptional fusions of the omp25 upstream region to the lacZ promotorless reporter gene were created. The first fusion had 392 bp upstream omp25. Likewise, two more fragments were cloned containing 262 bp and 151 bp of the same region. The expression of the transcriptional fusions in the wild type Brucella abortus 2308 strain was evaluated during its growth phase. These assays proved the presence of a growth phase dependent promoter activity in two of the constructions and a more than 90% reduction in gene expression of the construct containing the 151 bp fragment, outlining the region that has promoter activity. Therefore, a basal promoter activity is located within 151 bp upstream of omp25. This activity is positively regulated by further upstream sequences. This characterization could be used as a model for comparative studies with other regulatory regions in other important Brucella genes, and in this way create better tools to control their expression and therefore this pathogen.