Characterization of Brucella abortus and Brucella melitensis native haptens as outer membrane O-type polysaccharides independent from the smooth lipopolysaccharide

Abstract

Brucella native haptens (NHs) extracted with hot water from smooth (S)- type B. abortus and B. melitensis were purified to high levels of serological activity and compared with the polysaccharide obtained by acid hydrolysis (PS) of the S lipopolysaccharide (S-LPS). By 13C nuclear magnetic resonance analysis, NHs showed the spectrum of a homopolymer of α-1,2- or α-1,2- plus α-1,3-linked 4-formamido-4,6-dideoxy-D-mannose (N-formylperosamine) previously reported for the LPS O chain. However, while PS contained up to 0.6% 3-deoxy-D-manno-2-octulosonate, this LPS-core marker was absent from NH. High performance liquid chromatography and thin-layer chromatography showed heterogeneity in NH purified from whole cells but not in PS. By immunoprecipitation, polysaccharides indistinguishable from NH were demonstrated in extracts obtained with phenol-water, saline at 60°C, and ether-water treatments, and none of these treatments caused S-LPS hydrolysis detectable with antibodies to the O chain and lipid A. Two lines of evidence showed that NH was in the cell surface. First, NH became biotinylated when B. abortus live cells were labelled with biotin-hydrazide, and the examination of cell fractions and electron microscopy sections with streptavidin- peroxidase and streptavidin-coloidal gold, respectively, showed that labelling was extrinsic. Moreover, whereas only traces of NH were found in cytosols, the amount of NH was enriched in cell envelopes and in the outer membrane blebs spontaneously released by brucellae during growth. Interactions between NH and S-LPS were observed in crude cell extracts, and such interactions could be reconstituted by using purified NH and LPS. The results demonstrate that NH is not a hydrolytic product of S-LPS and suggest a model in which LPS-independent O-type polysaccharides (NH) are intertwined with the O chain in the outer membrane of S-type brucellae.

Los haptenos nativos de Brucella (NHs) extraídos con agua caliente de B. abortus y B. melitensis de tipo liso (S) fueron purificados hasta alcanzar altos niveles de actividad serológica y comparados con el polisacárido obtenido por hidrólisis ácida (PS) del lipopolisacárido S (S-LPS). Por análisis de resonancia magnética nuclear de 13C, los NHs mostraron el espectro de un homopolímero de a-1,2- o de a-1,2- más a-1,3 ligado a 4-formamido-4,6-dideoxy-D-manosa (Nformilperosamina) previamente reportado para la cadena O del LPS. Sin embargo, mientras que el PS contenía hasta un 0,6% de 3-desoxiD-manno-2-octulosonato, este marcador del núcleo del LPS estaba ausente en el NH. La cromatografía líquida de alto rendimiento y la cromatografía en capa fina mostraron heterogeneidad en el NH purificado a partir de células enteras, pero no en el PS. Mediante inmunoprecipitación, se demostraron polisacáridos indistinguibles del NH en extractos obtenidos con fenol-agua, solución salina a 60&C, y tratamientos de éter-agua, y ninguno de estos tratamientos causó hidrólisis de S-LPS detectable con anticuerpos contra la cadena O y el lípido A. Dos líneas de evidencia mostraron que el NH estaba en la superficie celular. En primer lugar, el NH se biotiniló cuando se marcaron células vivas de B. abortus con biotina-hidrazida, y el examen de fracciones celulares y secciones de microscopía electrónica con estreptavidina-peroxidasa y estreptavidina-oro coloidal, respectivamente, demostró que el etiquetado era extrínseco. Además, mientras que en los citosoles sólo se encontraron trazas de NH en los citosoles, la cantidad de NH se enriquecía en las envolturas celulares y en las burbujas de la membrana externa liberadas espontáneamente por las brucelas durante el crecimiento. Se observaron interacciones entre el NH y el S-LPS en extractos celulares crudos, y dichas interacciones podían reconstituirse utilizando NH y LPS purificados. Los resultados demuestran que el NH no es un producto hidrolítico del S-LPS y sugieren un modelo en el que los polisacáridos de tipo O independientes del LPS Los polisacáridos de tipo O (NH) se entrelazan con la cadena O en la membrana externa de las brucelas de tipo S.