Caracterización molecular del virus de la rabia en muestras analizadas en el SENASA en el período 2015-2017

Abstract

La rabia es una enfermedad infecciosa y zoonótica causada por un virus neurotrópico del género Lyssavirus. Su transmisión se da principalmente mediante mordeduras de mamíferos carnívoros o quirópteros. Esta zoonosis causa una encefalomielitis, usualmente fatal, por lo que se considera una de las amenazas más importantes para la salud pública a nivel mundial. En América Latina ha disminuido considerablemente el número de casos asociados a rabia canina; sin embargo, las variantes de rabia silvestre continúan presentando un riesgo, siendo los quirópteros hematófagos los transmisores principales en los casos humanos de la región. En cuanto a Costa Rica, la enfermedad se da principalmente en ganado, siendo los murciélagos el reservorio y principal vector que mantiene el virus endémico en el país. Actualmente no se conoce con exactitud la situación de Costa Rica en cuanto a rabia silvestre, ya que no fue sino hasta el 2016 que se empezaron a realizar tipificaciones de los virus involucrados en los brotes. Tal como se esperaba, la mayoría de los casos analizados fueron transmitidos por Desmodus rotundus, con excepción de uno de ellos que estaba asociado a una variante viral presente en Tadarida brasiliensis. Este último fue el primer caso asociado a esta especie en el país, por lo que dejó una gran interrogante acerca de la diversidad genética de los virus de rabia presentes en Costa Rica. En la presente práctica dirigida se efectuó la caracterización molecular del virus de la rabia en muestras analizadas en el SENASA entre los años 2015 y 2017. Se realizó una reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) para amplificar el gen de la nucleoproteína (N); sin embargo, debido a la obtención de múltiples productos inespecíficos se procedió a optimizar el ensayo. Para esto se modificó el método de extracción de ARN, así como la temperatura de alineamiento de los cebadores (Tm), la concentración de MgCl2, las concentraciones de cebadores y ARN de las muestras, y las condiciones del ciclaje. A pesar de que mejoró considerablemente la sensibilidad del ensayo, no se pudo eliminar la amplificación de productos inespecíficos, por lo que se purificó el ADN directamente del gel de electroforesis para proceder con la secuenciación. Se obtuvieron 12 secuencias, no obstante, únicamente seis de ellas se pudieron ensamblar y comparar con la secuencia de referencia. Mediante un análisis filogenético, se determinó que todas las secuencias estaban relacionadas a cepas originarias de D. rotundus, y que además provenían de un ancestro en común. De esta manera se demostró que D. rotundus continúa siendo el principal reservorio y vector de la rabia silvestre en el país, infectando primordialmente bovinos.

Rabies is an infectious and zoonotic disease caused by a neurotropic virus from the Lyssavirus genus. It is mainly transmitted by bites, either from carnivore mammals or bats. This zoonosis causes an encephalomyelitis that is usually fatal, so it is considered one of the most important threats for public health worldwide. In Latin America the number of reported cases of canine rabies has decreased significantly, however, wild rabies variants continue to represent a risk in the area, being hematophagous bats the main transmitters of human cases in the region. In Costa Rica the disease mainly affects cattle, where bats are the major reservoir and vector, keeping the virus endemic in the country. There is not much information about the current situation of Costa Rica regarding wild rabies, as it wasn’t until 2016 that they started sequencing the viruses involved in the outbreaks. Just as expected, the majority of the analyzed cases where transmitted by Desmodus rotundus, however, one of them was associated to a viral variant present in Tadarida brasiliensis. This was the first report of rabies transmitted by this species in Costa Rica, which left many unanswered questions about the genetic diversity of rabies virus present in the country. This internship intended to carry out the molecular characterization of the rabies virus in samples analyzed by SENASA in the period from 2015 to 2017. An RT-PCR was performed for the amplification of the nucleoprotein gene (N); nevertheless, multiple non-specific products where obtained, so it was necessary to perform an optimization of the essay. Some modifications where done to accomplish this, such as the extraction method, primers melting temperature (Tm), MgCl2 concentration, primers and RNA concentration and cycling conditions. Although the sensitivity of the essay improved, the amplification of the non-specific products couldn’t be eliminated, so DNA was purified directly from the electrophoresis gel to proceed with sequencing. Twelve sequences were obtained, however, only six of them were assembled and compared to the reference sequence. Additionally, it was determined by a phylogenetic analysis that all the strains originated from D. rotundus and came from a common ancestor. These results show that D. rotundus continues to be the major reservoir and vector of wild rabies in the country, infecting cattle primarily.