Evaluación de la actividad larvicida de la actinoporina nigrelisina (Ng) proveniente de la anemona de mar Anthopleura nigrescens sobre larvas de la familia Culicidae, clase Insecta, como un posible uso de control biológico de vectores de enfermedades

Abstract

Resumen. Las actinoporinas, como la Ng, se unen a la esfingomielina de la membrana celular y presentan actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos, también propiedades antibacterianas y antifúngicas. Aunque no se ha investigado la interacción de actinoporinas con membranas de insectos, se presume su efectividad debido a los esfingolípidos presentes. Estudios en insectos, especialmente el género Aedes, vectores de enfermedades, son vitales para entender y controlar enfermedades transmitidas por picaduras. La producción de Ng conllevó clonación, expresión y purificación. Se utilizaron células de Escherichia coli transformadas con el vector Ng-pET-21a (+) y se evaluó la expresión proteica en E. coli mediante SDS-PAGE con muestras no reductoras, registrándose un peso molecular 20 kDa. La proteína recombinante se purificó por FPLC en un solo paso de intercambio catiónico. La evaluación de la pureza por medio de RP-HPLC indicó una pureza de un 92% y un tiempo de retención de 24.5 min. La concentración máxima usada de esta toxina (74 nM), mostró una alta hemólisis evidenciada por pérdida de turbidez, la cual se mantuvo hasta una concentración de 0.29 nM. Los huevos de A. aegypti se desarrollaron a larvas en estadio instar 1-2 y se expusieron a concentraciones de Ng desde 0.000375 μg/μL hasta 0.07 μg/μL. Además, las larvas se sometieron a StI con cantidades estándar de 0.001875 μg/μL a 0.02 μg/μL. La exposición a Ng hasta 0.07 μg/μL no mostró letalidad, mientras que StI presentó una CL50 de 0.0098 μg/μL, evidenciando un efecto letal a concentraciones menores con StI. Aunque los protocolos de obtención recombinante de Ng son eficientes y permiten obtener la proteína pura y activa, Ng no mostró letalidad en larvas de A. aegypti, mientras que StI sí lo fue. Este estudio sugiere investigar más sobre el mecanismo molecular de las actinoporinas para entender la divergencia en su acción larvicida.

Abstract. Actinoporins, such as Ng, bind to cell membrane sphingomyelin and exhibit hemolytic activity on human erythrocytes, as well as antibacterial and antifungal properties. Although the interaction of actinoporins with insect membranes has not been investigated, their effectiveness is presumed due to the sphingolipids present. Studies on insects, especially the disease vector genus Aedes, are vital for understanding and controlling bite-borne diseases. Ng production involved cloning, expression and purification. Escherichia coli cells transformed with the Ng-pET-21a (+) vector were used and protein expression in E. coli was assessed by SDS-PAGE with non-reducing samples, recording a molecular weight of 20 kDa. The recombinant protein was purified by FPLC in a single cation exchange step. Purity evaluation by RP-HPLC indicated a purity of 92% and a retention time of 24.5 min. The maximum concentration of this toxin used (74 nM), showed a high hemolysis evidenced by loss of turbidity, which was maintained up to a concentration of 0.29 nM. A. aegypti eggs were developed to instar stage 1-2 larvae and exposed to Ng concentrations from 0.000375 μg/μL to 0.07 μg/μL. In addition, larvae were subjected to StI with standard amounts from 0.001875 μg/μL to 0.02 μg/μL. Exposure to Ng up to 0.07 μg/μL showed no lethality, whereas StI presented an LC50 of 0.0098 μg/μL, evidencing a lethal effect at lower concentrations with StI. Although Ng recombinant elicitation protocols are efficient and allow obtaining pure and active protein, Ng did not show lethality in A. aegypti larvae, while StI did. This study suggests further research on the molecular mechanism of actinoporins to understand the divergence in their larvicidal action.