Estandarización de un protocolo para la caracterización molecular de aislamientos de bacterias del género Brucella

Abstract

La brucelosis es la enfermedad zoonótica más extendida a nivel mundial. Es causada por una bacteria Gram negativa perteneciente al género Brucella, el cual incluye nueve especies distintas e infectantes de mamíferos terrestres y marinos (Cloeckáert et al., 2003; Corbel, 1997; Foster et al., 2007). Cada especie de Brucella presenta variaciones en la secuencia de ADN que afectan a los nucleótidos en una posición específica del genoma. A estas variaciones se les llama polimorfismo (Scott et al., 2007). El polimorfismo de las especies de Brucella localizado en los genes que codifican para las proteínas glk, omp25 y trpE, se utilizó para desarrollar un ensayo múltiple basado en la extensión de cebadores, con el cual se permite identificar a un aislamiento como miembro de una de las nueve especies reconocidas (Scott et al., 2007, Whatmore et al., 2007). Los métodos tradicionales para la identificación de Brucella a nivel de especie, consumen mucho tiempo y ponen en riesgo al personal laboratorial (Scott et al., 2007). Es por ello que la finalidad de este trabajo es evitar la ambigüedad, agilizar el procedimiento, disminuir el tiempo de respuesta y generar una herramienta laboratorial más efectiva para mejorar la vigilancia epidemiológica, el diagnóstico y abordaje de la brucelosis en Costa Rica. El siguiente trabajo presenta la estandarización del protocolo para la extracción de ADN de Brucella, la estandarización de una serie de amplificaciones de fragmentos de genes de interés por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la estandarización de la reacción de extensión de cebadores.Brucellosis is the most extensive zoonotic disease worldwide. It is caused by a Gram negative bacteria of the genus Brucella comprising nine distinct species pathogenic for terrestrial and marine mammals (Cloeckáert et al., 2003; Corbel, 1997; Foster et al., 2007; Scott et al., 2007). Each Brucella species presents nucleotide variations in the DNA that causes changes in specific positions of the genome. These changes are named polimorfisms. The polimorfism in the genes that codify for the glk, omp25 y trpE proteins of Brucella species (Scott et al., 2007) was used to develope a multiple assay based in the primer extension method, to identify a bacterial isolate and include them within one of the nine recognized Brucella species (Scott et al., 2007, Whatmore et al., 2007). The traditional methods to identify the Brucella species can be time-consuming, and require extensive manipulation of the isolates the assays may pose a hazard to laboratory personnel (Scott et al., 2007). The objective of this paperwork was to simplify the identification procedures, reduce the time of identification and generation of an efficient and unambiguous diagnostic tool for epidemiological vigilance and diagnosis of brucellosis. This thesis presents the standarization procedures required to extract Brucella DNA, the standardization of Polimerase Chain Reactions (PCR) and primer extension assays.