Microbial gene exchange on microplastic particles

Abstract

Plastic pollution is ubiquitous on the planet since several millions of tons of plastic waste enter aquatic ecosystems each year. Furthermore, the amount of plastic produced is expected to increase exponentially shortly. The heterogeneity of materials, additives and physical characteristics of plastics are typical of these emerging contaminants and affect their environmental fate in marine and freshwaters. Consequently, plastics can be found in the water column, sediments or littoral habitats of all aquatic ecosystems. Most of this plastic debris will fragment as a product of physical, chemical and biological forces, producing particles of small size. These particles (< 5mm) are known as “microplastics” (MP). Given their high surface-to-volume ratio, MP stimulate biofouling and the formation of biofilms in aquatic systems. As a result of their unique structure and composition, the microbial communities in MP biofilms are referred to as the “Plastisphere.” While there is increasing data regarding the distinctive composition and structure of the microbial communities that form part of the plastisphere, scarce information exists regarding the activity of microorganisms in MP biofilms. This surface-attached lifestyle is often associated with the increase in horizontal gene transfer (HGT) among bacteria. Therefore, this type of microbial activity represents a relevant function worth to be analyzed in MP biofilms. The horizontal exchange of mobile genetic elements (MGEs) is an essential feature of bacteria. It accounts for the rapid evolution of these prokaryotes and their adaptation to a wide variety of environments. The process of HGT is also crucial for spreading antibiotic resistance and for the evolution of pathogens, as many MGEs are known to contain antibiotic resistance genes (ARGs) and genetic determinants of pathogenicity. In general, the research presented in this Ph.D. thesis focuses on the analysis of HGT and heterotrophic activity in MP biofilms in aquatic ecosystems. The primary objective was to analyze the potential of gene exchange between MP bacterial communities vs. that of the surrounding water, including bacteria from natural aggregates. Moreover, the thesis addressed the potential of MP biofilms for the proliferation of biohazardous bacteria and MGEs from wastewater treatment plants (WWTPs) and associated with antibiotic resistance. Finally, it seeks to prove if the physiological profile of MP biofilms under different limnological conditions is divergent from that of the water communities. Accordingly, the thesis is composed of three independent studies published in peer-reviewed journals. The two laboratory studies were performed using both model and environmental microbial communities. In the field experiment, natural communities from freshwater ecosystems were examined. In Chapter I, the inflow of treated wastewater into a temperate lake was simulated with a concentration gradient of MP particles. The effects of MP on the microbial community structure and the occurrence of integrase 1 (int 1) were followed. The int 1 is a marker associated with mobile genetic elements and known as a proxy for anthropogenic effects on the spread of antimicrobial resistance genes. During the experiment, the abundance of int1 increased in the plastisphere with increasing MP particle concentration, but not in the surrounding water. In addition, the microbial community on MP was more similar to the original wastewater community with increasing microplastic concentrations. Our results show that microplastic particles indeed promote persistence of standard indicators of microbial anthropogenic pollution in natural waters. In Chapter II, the experiments aimed to compare the permissiveness of aquatic bacteria towards model antibiotic resistance plasmid pKJK5, between communities that form biofilms on MP vs. those that are free-living. The frequency of plasmid transfer in bacteria associated with MP was higher when compared to bacteria that are free-living or in natural aggregates. Moreover, comparison increased gene exchange occurred in a broad range of phylogenetically-diverse bacteria. The results indicate a different activity of HGT in MP biofilms, which could affect the ecology of aquatic microbial communities on a global scale and the spread of antibiotic resistance. Finally, in Chapter III, physiological measurements were performed to assess whether microorganisms on MP had a different functional diversity from those in water. General heterotrophic activity such as oxygen consumption was compared in microcosm assays with and without MP, while diversity and richness of heterotrophic activities were calculated by using Biolog® EcoPlates. Three lakes with different nutrient statuses presented differences in MP-associated biomass build up. Functional diversity profiles of MP biofilms in all lakes differed from those of the communities in the surrounding water, but only in the oligo- mesotrophic lake MP biofilms had a higher functional richness compared to the ambient water. The results support that MP surfaces act as new niches for aquatic microorganisms and can affect global carbon dynamics of pelagic environments. Overall, the experimental works presented in Chapters I and II support a scenario where MP pollution affects HGT dynamics among aquatic bacteria. Among the consequences of this alteration is an increase in the mobilization and transfer efficiency of ARGs. Moreover, it supposes that changes in HGT can affect the evolution of bacteria and the processing of organic matter, leading to different catabolic profiles such as demonstrated in Chapter III. The results are discussed in the context of the fate and magnitude of plastic pollution and the importance of HGT for bacterial evolution and the microbial loop, i.e., at the base of aquatic food webs. The thesis supports a relevant role of MP biofilm communities for the changes observed in the aquatic microbiome as a product of intense human intervention.

Mikroplastikpartikel tatsächlich die Persistenz von Standardindikatoren mikrobieller anthropogener Verschmutzung in natürlichen Gewässern fördern. In Kapitel II wurde die Permissivität von aquatischen Bakterien gegen das Modell-Plasmid für Antibiotikaresistenz pKJK5 zwischen Gemeinschaften, die Biofilme auf MP bilden, gegenüber denen, die frei leben, verglichen. Die Häufigkeit des Plasmidtransfers unter den MP-assoziierten Bakterien war höher als unter Bakterien, die frei oder in natürlichen Aggregaten leben. Der verstärkte Genaustausch trat darüber hinaus bei einem breiten Spektrum phylogenetisch diverser Bakterien auf. Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Aktivität von HGT in MP-Biofilmen hin, welche die Ökologie aquatischer mikrobieller Gemeinschaften auf globaler Ebene sowie die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beeinflussen könnten. Schließlich wurden in Kapitel III physiologische Messungen durchgeführt, um festzustellen, ob Mikroorganismen auf MP eine andere funktionelle Diversität aufwiesen als jene im Wasser. Die generelle heterotrophe Aktivität, wie der Sauerstoffverbrauch, wurde in Mikrokosmentests mit und ohne MP verglichen, während die Diversität und Vielfalt heterotropher Aktivitäten mit Hilfe von Biolog® EcoPlates berechnet wurden. Drei Seen mit unterschiedlichen Nährstoffbedingungen wiesen Unterschiede in der Ausprägung der MP- assoziierten Biomasse auf. In allen Seen unterschieden sich die funktionellen Diversitätsprofile der MP-Biofilme von denen der Gemeinschaften im umgebenden Wasser, aber nur die MP-Biofilme des oligo-mesotrophen Sees hatten eine höhere funktionelle Vielfalt im Verglichen zum Umgebungswasser. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass MP- Oberflächen als neue Nischen für aquatische Mikroorganismen fungieren und die globale Kohlenstoffdynamik im Pelagial beeinflussen können. Insgesamt unterstützen die in den Kapiteln I und II vorgestellten experimentellen Studien ein Szenario, in dem die Umweltverschmutzung durch MP die HGT-Dynamik zwischen aquatischen Bakterien beeinflusst. Zu den Folgen dieser Veränderung gehört eine Erhöhung der Mobilisierungs- und Übertragungseffizienz von ARGs. Darüber hinaus wird vermutet, dass eine Beeinflussung des HGT die Evolution von Bakterien und die Umsetzung von organischem Material verändern könnte, was zu verschiedenen katabolischen Profilen führt, wie in Kapitel III gezeigt. Die Ergebnisse werden in Zusammenhang mit dem Ausmaß der Plastikverschmutzung sowie der Bedeutung von HGT für die bakterielle Entwicklung und “ikrobielle Schleife“, d. h. an der Basis der aquatischen Nahrungsnetze, diskutiert. Diese Doktorarbeit veranschaulicht die Bedeutung von MP-Biofilmgemeinschaften für die beobachteten Veränderungen des aquatischen Mikrobioms als eine Folge der intensive anthropogenen Eingriffe.

La contaminación plástica es omnipresente en el planeta ya que varios millones de toneladas de desechos plásticos ingresan a los ecosistemas acuáticos cada año. Además, se espera que la cantidad de plástico producido aumente exponencialmente en breve. La heterogeneidad de materiales, aditivos y características físicas de los plásticos son típicos de estos contaminantes emergentes y afectan su destino ambiental en aguas marinas y dulces. En consecuencia, los plásticos se pueden encontrar en la columna de agua, sedimentos o hábitats litorales de todos los ecosistemas acuáticos. La mayor parte de estos desechos plásticos se fragmentarán como producto de fuerzas físicas, químicas y biológicas, produciendo partículas de pequeño tamaño. Estas partículas (< 5 mm) se conocen como “microplásticos” (MP). Dada su alta relación superficie-volumen, las MP estimulan la bioincrustación y la formación de biopelículas en los sistemas acuáticos. Como resultado de su estructura y composición únicas, las comunidades microbianas en las biopelículas MP se denominan "plastisfera". Si bien hay cada vez más datos sobre la composición y estructura distintivas de las comunidades microbianas que forman parte de la plastisfera, existe poca información sobre la actividad de los microorganismos en las biopelículas de MP. Este estilo de vida adherido a la superficie a menudo se asocia con el aumento de la transferencia horizontal de genes (HGT) entre las bacterias. Por lo tanto, este tipo de actividad microbiana representa una función relevante que vale la pena analizar en biopelículas MP. El intercambio horizontal de elementos genéticos móviles (MGEs) es una característica esencial de las bacterias. Da cuenta de la rápida evolución de estos procariotas y su adaptación a una amplia variedad de entornos. El proceso de HGT también es crucial para la propagación de la resistencia a los antibióticos y para la evolución de los patógenos, ya que se sabe que muchos MGE contienen genes de resistencia a los antibióticos (ARG) y determinantes genéticos de patogenicidad. En general, la investigación presentada en este Ph.D. La tesis se centra en el análisis de HGT y la actividad heterótrofa en biopelículas MP en ecosistemas acuáticos. El objetivo principal fue analizar el potencial de intercambio de genes entre las comunidades bacterianas MP frente al agua circundante, incluidas las bacterias de los agregados naturales. Además, la tesis abordó el potencial de las biopelículas MP para la proliferación de bacterias biopeligrosas y MGE de las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) y se asoció con la resistencia a los antibióticos. Finalmente, busca probar si el perfil fisiológico de las biopelículas de MP bajo diferentes condiciones limnológicas es divergente al de las comunidades de agua. En consecuencia, la tesis se compone de tres estudios independientes publicados en revistas revisadas por pares. Los dos estudios de laboratorio se realizaron utilizando comunidades microbianas ambientales y modelo. En el experimento de campo, se examinaron comunidades naturales de ecosistemas de agua dulce. En el Capítulo I, se simuló el ingreso de aguas residuales tratadas a un lago templado con un gradiente de concentración de partículas MP. Se siguieron los efectos de MP en la estructura de la comunidad microbiana y la aparición de integrasa 1 (int 1). El int 1 es un marcador asociado con elementos genéticos móviles y conocido como indicador de los efectos antropogénicos en la propagación de genes de resistencia a los antimicrobianos. Durante el experimento, la abundancia de int1 aumentó en la plastisfera con el aumento de la concentración de partículas MP, pero no en el agua circundante. Además, la comunidad microbiana en MP era más similar a la comunidad original de aguas residuales con concentraciones crecientes de microplásticos. Nuestros resultados muestran que las partículas microplásticas promueven la persistencia de indicadores estándar de contaminación antropogénica microbiana en aguas naturales. En el Capítulo II, los experimentos tuvieron como objetivo comparar la permisividad de bacterias acuáticas hacia el plásmido modelo de resistencia a antibióticos pKJK5, entre comunidades que forman biopelículas sobre MP vs. aquellas que son de vida libre. La frecuencia de transferencia de plásmidos en bacterias asociadas con MP fue mayor en comparación con las bacterias de vida libre o en agregados naturales. Además, se produjo un mayor intercambio de genes en comparación en una amplia gama de bacterias filogenéticamente diversas. Los resultados indican una actividad diferente de HGT en las biopelículas MP, lo que podría afectar la ecología de las comunidades microbianas acuáticas a escala global y la propagación de la resistencia a los antibióticos. Finalmente, en el Capítulo III, se realizaron mediciones fisiológicas para evaluar si los microorganismos en MP tenían una diversidad funcional diferente a los del agua. La actividad heterótrofa general, como el consumo de oxígeno, se comparó en ensayos de microcosmos con y sin MP, mientras que la diversidad y la riqueza de las actividades heterótrofas se calcularon utilizando Biolog® EcoPlates. Tres lagos con diferentes estados de nutrientes presentaron diferencias en la acumulación de biomasa asociada a MP. Los perfiles de diversidad funcional de las biopelículas MP en todos los lagos diferían de los de las comunidades en el agua circundante, pero solo en las biopelículas MP del lago oligomesotrófico tenía una mayor riqueza funcional en comparación con el agua ambiente. Los resultados respaldan que las superficies MP actúan como nuevos nichos para los microorganismos acuáticos y pueden afectar la dinámica global del carbono de los ambientes pelágicos. En general, los trabajos experimentales presentados en los Capítulos I y II respaldan un escenario en el que la contaminación por MP afecta la dinámica de HGT entre las bacterias acuáticas. Entre las consecuencias de esta alteración se encuentra un aumento en la eficiencia de movilización y transferencia de los ARG. Además, supone que los cambios en la HGT pueden afectar la evolución de las bacterias y el procesamiento de la materia orgánica, dando lugar a diferentes perfiles catabólicos como se demuestra en el Capítulo III. Los resultados se discuten en el contexto del destino y la magnitud de la contaminación plástica y la importancia de HGT para la evolución bacteriana y el ciclo microbiano, es decir, en la base de las redes alimentarias acuáticas. La tesis sustenta un papel relevante de las comunidades de biopelículas MP para los cambios observados en el microbioma acuático como producto de la intensa intervención humana.