Establishment of a minor groove binder-probe based quantitative real time PCR to detect Borrelia burgdorferi sensu lato and differentiation of Borrelia spielmanii by ospA-specific conventional PCR

Abstract

Background: Borrelia burgdorferi sensu lato (sl), the causative agent of Lyme borreliosis, is transmitted by ticks of the genus Ixodes as vector. For identification of Borrelia infections in ticks a TaqManTM minor groove binder (MGB) probe-based quantitative real time PCR (qPCR) was established targeting the 5S-23S intergenic spacer. Extension to

a duplex qPCR included an Ixodes spp. positive control to verify successful DNA isolation. Besides qPCR, an ospA- specific conventional PCR for species-specific identification of B. spielmanii was established. Afterwards 1000 I.

ricinus flagged in the city of Hanover, Germany, were investigated for B. burgdorferi sl infections followed by species identification. Furthermore, I. hexagonus ticks were investigated to proof applicability of the PCRs. Results: Quantitative real time PCR (qPCR) identifying B. burgdorferi sl in ticks was able to detect 1-10 copies per reaction. B. spielmanii ospA-specific conventional PCR was also highly specific and showed no cross reactions with the other tested Borrelia species. From 1000 hanoveranian ticks 24.3% were positive compared to only 7.4% positives by dark-field microscopy. Related to tick stage 1.7% larvae, 18.1% nymphs, and 34.6% adults were positive. The most frequent species was B. garinii, followed by B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana and B. burgdorferi sensu stricto (ss). 70.6% of I. ricinus were mono-infected, whereas 28.0% and 1.4% were infected with two and three Borrelia species, respectively. From 232 I. hexagonus collected from hedgehogs in different sites of Germany, qPCR detected 5.7% to be infected with B. burgdorferi sl, which were identified as B. afzelii, B. garinii and B. spielmanii. Conclusions: The evaluated qPCR to detect B. burgdorferi sl in Ixodes spp. is highly specific and sensitive. As a duplex qPCR including detection of Ixodes spp. DNA it is the first DNA based technique incorporating a control for successful DNA isolation from the vector tick. Establishment of a B. spielmanii specific conventional PCR filled the gap in PCR identification of principal European Borrelia genospecies. Practical application showed that all European pathogenic Borrelia spp. were present in I. ricinus flagged in recreational areas of the city of Hanover and confirmed I. hexagonus as reservoir for pathogenic Borrelia spp.Antecedentes: Borrelia burgdorferi sensu lato (sl), el agente causante de la borreliosis de Lyme, es transmitido por garrapatas del del género Ixodes como vector. Para la identificación de las infecciones por Borrelia en las garrapatas se utiliza una sonda TaqManTM minor groove binder (MGB) basada en la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) dirigida al espaciador intergénico 5S-23S. La ampliación a

una qPCR dúplex incluyó un control positivo de Ixodes spp. para verificar el aislamiento exitoso del ADN. Además de la qPCR, se realizó una PCR convencional específica para ospA para la identificación específica de la especie B. spielmanii. Posteriormente, se identificaron 1.000 ejemplares de I.

ricinus marcados en la ciudad de Hannover, Alemania, fueron investigados en busca de infecciones por B. burgdorferi sl seguido de identificación de la especie. Además, se investigaron garrapatas de I. hexagonus para probar la aplicabilidad de las PCR. Resultados: La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para la identificación de B. burgdorferi sl en garrapatas fue capaz de detectar entre 1 y 10 copias por reacción. La PCR convencional específica de B. spielmanii ospA también fue altamente específica y no mostró reacciones cruzadas con con las otras especies de Borrelia analizadas. De 1.000 garrapatas de Hannover, el 24,3% fueron positivas en comparación con sólo el 7,4% positivos por microscopía de campo oscuro. En relación con el estadio de la garrapata, el 1,7% de las larvas, el 18,1% de las ninfas y el 34,6% de los adultos fueron positivos. La especie más frecuente fue B. garinii, seguida de B. afzelii, B. spielmanii, B. valaisiana y B. burgdorferi sensu stricto (ss). El 70,6% de I. ricinus estaban monoinfectados, mientras que el 28,0% y el 1,4% estaban infectados con dos y tres especies de Borrelia, respectivamente. De los 232 I. hexagonus recogidos en erizos en diferentes lugares de Alemania, la qPCR detectó que el 5,7% estaban infectados con B. burgdorferi sl, que se identificaron como B. afzelii, B. garinii y B. spielmanii. Conclusiones: La qPCR evaluada para detectar B. burgdorferi sl en Ixodes spp. es altamente específica y sensible. Como una Como qPCR dúplex que incluye la detección del ADN de Ixodes spp. es la primera técnica basada en el ADN que incorpora un control para aislamiento exitoso del ADN de la garrapata vectorial. El establecimiento de una PCR convencional específica de B. spielmanii llenó el de la identificación por PCR de las principales genoespecies europeas de Borrelia. La aplicación práctica demostró que todas las Borrelia spp. Borrelia spp. patógenas europeas estaban presentes en I. ricinus marcados en zonas de recreo de la ciudad de Hannover y confirmó que I. hexagonus es un reservorio de Borrelia spp. patógena.