Tyr→Trp-substituted peptide 115-129 of a Lys49 phospholipase A2 expresses enhanced membrane-damaging activities and reproduces its in vivo myotoxic effect

Abstract

Myotoxin II is a group II Lys49 phospholipase A2 (PLA2) isolated from the venom of the snake Bothrops asper. Previous studies on a synthetic peptide derived from its heparin-binding, cationic/hydrophobic sequence 115^129 demonstrated a direct functional role of this particular region in the in vitro cytolytic and bactericidal actions of the protein. Nevertheless, no significant myonecrosis has been observed after local intramuscular injection of peptide 115-129 (p115-129) in mice. Since the membrane-damaging action of p115-129 was proposed to depend on its amphiphilic character, the present study examined the effects of substituting its cluster of three tyrosine residues by tryptophan residues, on its toxic/pharmacological activities in vitro and in vivo. This substitution resulted in a drastic enhancement of the membrane-damaging activities of the peptide (p115-W3), together with the clear expression of myotoxic activity in vivo. Both the heparin-binding and antigenic characteristics of p115-129 were essentially conserved in p115-W3, suggesting that the modification did not lead to radical structural alterations. In addition to myotoxicity, cytotoxicity, and bactericidal action, p115-W3 exerted edema-forming activity in the mouse footpad assay. Thus, the synthetic 13-mer p115-W3 reproduced all the known toxic effects of myotoxin II. In spite of its potent membrane-damaging actions, p115-W3 did not acquire direct hemolytic activity upon mouse erythrocytes, an effect which is not present in myotoxin II, but that has been ascribed to the presence of tryptophan in other cationic, membrane-damaging peptides such as mellitin from bee venom. The myotoxic activity of p115-W3 herein described constitutes the first example of a short, PLA2-based linear synthetic peptide with the ability to reproduce this effect of a parent protein in vivo. This finding is in clear support of the proposed relevance of the C-terminal region 115^129 in all the membrane-damaging mechanisms exerted by myotoxin II, including the myotoxic mechanism.La miotoxina II es una fosfolipasa A2 (PLA2) Lys49 del grupo II aislada del veneno de la serpiente Bothrops asper. Estudios previos sobre un péptido sintético derivado de su secuencia 115^129 catiónica/hidrofóbica que se une a la heparina demostraron una función directa de esta región concreta en las acciones citolíticas y bactericidas in vitro de la proteína. Sin embargo, no se ha observado ninguna mionecrosis significativa tras la inyección intramuscular local del péptido 115-129 (p115-129) en ratones. Dado que se propuso que la acción dañina para la membrana del p115-129 dependía de su carácter anfifílico, el presente estudio examinó los efectos de sustituir su grupo de tres residuos de tirosina por residuos de triptófano, en sus actividades tóxicas/farmacológicas in vitro e in vivo. Esta sustitución dio lugar a una mejora drástica de las actividades dañinas para la membrana del péptido (p115-W3), junto con la clara expresión de la actividad miotóxica in vivo. Tanto las características de unión a la heparina como las antigénicas del p115-129 se conservaron esencialmente en el p115-W3, lo que sugiere que la modificación no condujo a alteraciones estructurales radicales . Además de la miotoxicidad, la citotoxicidad y la acción bactericida, el p115-W3 ejerció actividad formadora de edemas en el ensayo de la almohadilla plantar del ratón. Así, el p115-W3 sintético de 13 meros reprodujo todos los efectos tóxicos conocidos de la miotoxina II. A pesar de sus potentes acciones dañinas para la membrana, p115-W3 no adquirió actividad hemolítica directa sobre los eritrocitos de ratón, un efecto que no está presente en la miotoxina II, pero que se ha atribuido a la presencia de triptófano en otros péptidos catiónicos dañinos para la membrana, como la melitina del veneno de abeja. La actividad miotóxica de la p115-W3 aquí descrita constituye el primer ejemplo de un péptido sintético lineal corto, basado en PLA2, con la capacidad de reproducir este efecto de una proteína parental in vivo. Este hallazgo respalda claramente la relevancia propuesta de la región C-terminal 115^129 en todos los mecanismos de daño a la membrana ejercidos por la miotoxina II, incluido el mecanismo miotóxico.