Curing of Cocoa Beans: Fine-Scale Monitoring of the Starter Cultures Applied and Metabolomics of the Fermentation and Drying Steps

Abstract

Starter culture-initiated cocoa fermentation processes can be applied to improve the quality of cured cocoa beans. However, an accurate monitoring of the microbial strains inoculated in fresh cocoa pulp-bean mass to assess their contribution to the cocoa bean curing process is still lacking. In the present study, eight different cocoa fermentation processes were carried out with Trinitario cocoa in vessels in Costa Rica to assess the contribution of two candidate yeast starter culture strains, namely Saccharomyces cerevisiae IMDO 050523 and Pichia kudriavzevii IMDO 020508, inoculated in combination with Limosilactobacillus fermentum IMDO 0611222 and Acetobacter pasteurianus IMDO 0506386. A multiphasic approach, consisting of culture-dependent selective plating and incubation, rRNA-PCR-DGGE community profiling of agar plate washes, and culture-independent high-throughput amplicon sequencing, combined with a metabolite target analysis of non-volatile and volatile organic compounds (VOCs), was performed on samples from the fermentation and/or drying steps. The different starter culture mixtures applied effectively steered the cocoa fermentation processes performed. Moreover, the use of an amplicon sequence variant (ASV) approach, aligning these ASVs to the whole-genome sequences of the inoculated strains, allowed the monitoring of these inoculated strains and their differentiation from very closely related variants naturally present in the background or spontaneous fermentation processes. Further, traits such as malolactic fermentation during the fermentation step and acetoin and tetramethylpyrazine formation during the drying step could be unraveled. Finally, the yeast strains inoculated influenced the substrate consumption and metabolite production during all starter culture-initiated fermentation processes. This had an impact on the VOC profiles of the cured cocoa beans. Whereas the P. kudriavzevii strain produced a wide range of VOCs in the cocoa pulp, the S. cerevisiae strain mostly influenced the VOC composition of the cured cocoa beans.

Se pueden aplicar procesos de fermentación de cacao iniciados por cultivo iniciador para mejorar la calidad de los granos de cacao curados. Sin embargo, aún falta un seguimiento preciso de las cepas microbianas inoculadas en la masa fresca de pulpa de cacao en grano para evaluar su contribución al proceso de curado del cacao en grano. En el presente estudio, se llevaron a cabo ocho procesos de fermentación de cacao diferentes con cacao Trinitario en recipientes en Costa Rica para evaluar la contribución de dos cepas de cultivo iniciador de levadura candidatas, a saber, Saccharomyces cerevisiae IMDO 050523 y Pichia kudriavzevii IMDO 020508, inoculadas en combinación con Limosilactobacillus fermentum. IMDO 0611222 y Acetobacter pasteurianus IMDO 0506386. Un enfoque multifásico, que consiste en cultivo en placa selectiva e incubación, elaboración de perfiles comunitarios de ARNr-PCR-DGGE de lavados en placa de agar y secuenciación de amplicones de alto rendimiento independiente del cultivo, combinada con un análisis de metabolitos diana de compuestos orgánicos volátiles y no volátiles (COV), se realizó en muestras de las etapas de fermentación y / o secado. Las diferentes mezclas de cultivos iniciadores aplicadas dirigieron eficazmente los procesos de fermentación del cacao realizados. Además, el uso de un enfoque de variante de secuencia de amplicón (ASV), alineando estos ASV con las secuencias del genoma completo de las cepas inoculadas, permitió el seguimiento de estas cepas inoculadas y su diferenciación de variantes muy estrechamente relacionadas presentes naturalmente en el fondo o espontáneamente Procesos de fermentación. Además, se podrían desentrañar rasgos como la fermentación maloláctica durante la etapa de fermentación y la formación de acetoína y tetrametilpirazina durante la etapa de secado. Finalmente, las cepas de levadura inoculadas influyeron en el consumo de sustrato y la producción de metabolitos durante todos los procesos de fermentación iniciados por el cultivo iniciador. Esto tuvo un impacto en los perfiles de COV de los granos de cacao curados. Mientras que la cepa de P. kudriavzevii produjo una amplia gama de COV en la pulpa de cacao, la cepa de S. cerevisiae influyó principalmente en la composición de COV de los granos de cacao curados.