Optimización de la técnica de PCR Punto Final y Tiempo Real para la detección de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Gallinarum en aislamientos bacterianos y tejidos biológicos obtenidos a partir de aves de corral

Abstract

Las especies del género Salmonella son importantes patógenos zoonóticos que ocasionan grandes pérdidas económicas y problemas sanitarios en todo el mundo. Dentro de estas se encuentra Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Gallinarum biotipo Gallinarum y biotipo Pullorum. Las enfermedades causadas por este serotipo son responsables de una elevada mortalidad en aves de corral generando daños económicos para los avicultores. Además, es de importancia epidemiológica y de reporte obligatorio por los servicios nacionales de salud veterinaria. En el presente estudio se llevó a cabo la estandarización de la PCR Punto Final y Tiempo Real (qPCR) para la detección de Salmonella Gallinarum/Pullorum en muestras de cultivo bacteriano y de tejidos biológicos provenientes de aves de corral con sintomatología sospechosa y previamente confirmadas como positivas. Para la PCR Punto Final se obtuvo una repetibilidad, especificidad y sensibilidad del 100%, y un valor Kappa de 0.98 para la reproducibilidad. Mientras que, para la PCR Tiempo Real se obtuvo una eficiencia del 103% y valores del coeficiente de variación menores al 6% para la repetibilidad y reproducibilidad. El límite de detección de ADN genómico fue de 6.4 pg/μL y el del número de células viables de 3x102 UFC/mL para la PCR Punto Final y de 10 copias de ADN por reacción para la qPCR. Mediante la secuenciación y análisis de los productos de PCR, el árbol filogenético obtenido posicionó a las cepas estudiadas junto con las del serotipo S. Gallinarum, corroborando su identidad. Además, se demostró la aplicabilidad de la técnica mediante la amplificación de muestras de tejido biológico. Por lo tanto, se logra optimizar una técnica molecular que permite una detección rápida, confiable y sensible de Salmonella Gallinarum/Pullorum, lo cual reducirá el tiempo de espera para tomar acción en casos de sospecha clínica y posibles brotes.

Species of the genus Salmonella are important zoonotic pathogens that cause great economic losses and health problems throughout the world. Among these is Salmonella enterica subsp. enterica serotype Gallinarum biotype Gallinarum and biotype Pullorum. The diseases caused by this serotype are responsible for high mortality in poultry, generating economic damage for poultry farmers. In addition, it is of epidemiological importance and mandatory reporting by the national veterinary health services. In the present study, the standardization of the Real-Time Endpoint PCR (qPCR) was carried out for the detection of Salmonella Gallinarum/Pullorum in samples of bacterial culture and biological tissues from poultry with suspicious symptoms and previously confirmed as positive. For the Endpoint PCR, a repeatability, specificity and sensitivity of 100% was obtained, and a Kappa value of 0.98 for reproducibility. While, for the Real Time PCR, an efficiency of 103% and coefficient of variation values ​​of less than 6% were obtained for repeatability and reproducibility. The detection limit for genomic DNA was 6.4 pg/μL and the number of viable cells was 3x102 CFU/mL for End Point PCR and 10 DNA copies per reaction for qPCR. Through the sequencing and analysis of the PCR products, the phylogenetic tree obtained positioned the studied strains together with those of the S. Gallinarum serotype, corroborating their identity. In addition, the applicability of the technique was demonstrated through the amplification of biological tissue samples. Therefore, it is possible to optimize a molecular technique that allows a fast, reliable and sensitive detection of Salmonella Gallinarum/Pullorum, which will reduce the waiting time to take action in cases of clinical suspicion and possible outbreaks.