Bacterial Genome Editing with CRISPR-Cas9: Taking Clostridium beijerinckii as an Example

Abstract

Abstract. CRISPR-Cas9 has been explored as a transformative genome engineering tool for many eukaryotic organisms. However, its utilization in bacteria remains limited and ineffective. This chapter, taking Clostridium beijerinckii as an example, describes the use of Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas9 system guided by the single chimeric guide RNA (gRNA) for diverse genome-editing purposes, including chromosomal gene deletion, integration, single nucleotide modification, as well as “clean” mutant selection. The general principle is to use CRISPR-Cas9 as an efficient selection tool for the edited mutant (whose CRISPR-Cas9 target site has been disrupted through a homologous recombination event and thus can survive selection) against? the wild type background cells. This protocol is broadly applicable to other microorganisms for genome-editing purposes.Resumen. CRISPR-Cas9 se ha explorado como una herramienta transformadora de ingeniería genómica para muchos organismos eucariotas. Sin embargo, su utilización en bacterias sigue siendo limitada e ineficaz. Este capítulo, tomando a Clostridium beijerinckii como ejemplo, describe el uso del sistema CRISPR-Cas9 de Streptococcus pyogenes guiado por el ARN guía quimérico único (ARNg) para diversos fines de edición del genoma, incluida la eliminación, integración y modificación de un solo nucleótido de genes cromosómicos como selección mutante "limpia". El principio general es utilizar CRISPR-Cas9 como una herramienta de selección eficaz para el mutante editado (cuyo sitio objetivo de CRISPR-Cas9 ha sido alterado mediante un evento de recombinación homóloga y, por lo tanto, puede sobrevivir a la selección). las celdas de fondo de tipo salvaje. Este protocolo es ampliamente aplicable a otros microorganismos con fines de edición del genoma.