Self-assembly study of type I collagen extracted from male Wistar Hannover rat tail tendons

Abstract

Background: Collagen, the most abundant protein in the animal kingdom, represents a promising biomaterial for regenerative medicine applications due to its structural diversity and self-assembling complexity. Despite collagen’s widely known structural and functional features, the thermodynamics behind its fibrillogenic self-assembling process is still to be fully understood. In this work we report on a series of spectroscopic, mechanical, morphological and thermodynamic characterizations of high purity type I collagen (with a D-pattern of 65 nm) extracted from Wistar Hannover rat tail. Our herein reported results can be of help to elucidate differences in selfassembly states of proteins using ITC to improve the design of energy responsive and dynamic materials for applications in tissue engineering and regenerative medicine. Methods: Herein we report the systematic study on the self-assembling fibrillogenesis mechanism of type I collagen, we provide morphological and thermodynamic evidence associated to different self-assembly events using ITC titrations. We provide thorough characterization of the effect of pH, effect of salts and protein conformation on self-assembled collagen samples via several complementary biophysical techniques, including circular dichroism (CD), Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC), atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM), dynamic mechanical thermal analysis (DMTA) and thermogravimetric analysis (TGA). Results: Emphasis was made on the use of isothermal titration calorimetry (ITC) for the thermodynamic monitoring of fibrillogenesis stages of the protein. An overall self-assembly enthalpy value of 3.27 ± 0.85 J/mol was found. Different stages of the self-assembly mechanism were identified, initial stages take place at pH values lower than the protein isoelectric point (pI), however, higher energy release events were recorded at collagen’s pI. Denatured collagen employed as a control exhibited higher energy absorption at its pI, suggesting different energy exchange mechanisms as a consequence of different aggregation routesAntecedentes: el colágeno, la proteína más abundante en el reino animal, representa un biomaterial prometedor para aplicaciones de medicina regenerativa debido a su diversidad estructural y complejidad de autoensamblaje. A pesar de las características estructurales y funcionales ampliamente conocidas del colágeno, la termodinámica detrás de su proceso de autoensamblaje fibrilogénico aún debe entenderse completamente. En este trabajo informamos sobre una serie de caracterizaciones espectroscópicas, mecánicas, morfológicas y termodinámicas de colágeno tipo I de alta pureza (con un patrón D de 65 nm) extraído de la cola de rata Wistar Hannover. Nuestros resultados aquí reportados pueden ayudar a dilucidar las diferencias en los estados de autoensamblaje de proteínas usando ITC para mejorar el diseño de materiales dinámicos y sensibles a la energía para aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Métodos: A continuación presentamos el estudio sistemático sobre el mecanismo de fibrilogénesis autoensamblante del colágeno tipo I, aportamos evidencia morfológica y termodinámica asociada a diferentes eventos de autoensamblaje mediante titulaciones ITC. Proporcionamos una caracterización completa del efecto del pH, el efecto de las sales y la conformación de proteínas en muestras de colágeno autoensambladas a través de varias técnicas biofísicas complementarias, que incluyen dicroísmo circular (CD), espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), calorimetría diferencial de barrido (DSC), microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica de barrido (SEM), análisis térmico mecánico dinámico (DMTA) y análisis termogravimétrico (TGA). Resultados: Se hizo énfasis en el uso de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para el monitoreo termodinámico de las etapas de fibrilogénesis de la proteína. Se encontró un valor de entalpía de autoensamblaje general de 3,27 ± 0,85 J / mol. Se identificaron diferentes etapas del mecanismo de autoensamblaje, las etapas iniciales tienen lugar a valores de pH más bajos que el punto isoeléctrico de la proteína (pI), sin embargo, se registraron eventos de liberación de energía más altos en el pI del colágeno. El colágeno desnaturalizado empleado como control exhibió una mayor absorción de energía en su pI, lo que sugiere diferentes mecanismos de intercambio de energía como consecuencia de diferentes rutas de agregación.