Incubación, pre-lisis y post-purificación en el rendimiento y pureza de ácidos nucleicos extraídos de sangre de cabras domésticas contenida en tarjetas FTA

Abstract

Técnicas moleculares requieren extracciones de ácidos nucleicos en cantidad y pureza adecuadas. Este trabajo describe un modelo lineal generalizado (GLM) de un factor ajustado con efectos fijos sobre el rendimiento de ácido nucleico (ng/μl) y la pureza (A260/A280 y A260/A230), para cinco métodos de extracción de ADN utilizando tarjetas FTA con sangre de cabra (Capra aegagrus hircus). Se ensayaron dos métodos comerciales basados en columnas de sílice (Invitrogen y Macherey Nagel; MN), método resina quelante (Chelex), método CTAB y el método de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI). Adicionalmente, para MN, se evaluó una etapa de incubación con tampón PBS (Phosphate Buffered Saline) en alta temperatura previa a la lisis y una etapa de purificación posterior a la extracción utilizando un modelo de efecto fijo de dos factores con interacción. Las concentraciones de ADN y las proporciones de pureza fueron variables; la concentración más alta se obtuvo con el kit MN (170.45 ng/μl), pero con deficiencias en la pureza (0.32 de A260/A230, 0.34 de A260/A280). A pesar de esto, todos los métodos de extracción generaron productos PCR con cebadores específicos D-loop (ADNmt). El efecto combinado de las etapas de pre-incubación y post-purificación arrojó valores de pureza satisfactorios (1.89 para A260/A230 y 1.65 para A260/A280), así como relaciones de concentración (476.78 ng/μl) con baja variabilidad. En conclusión, la concentración y pureza del ADN de muestras de sangre mejora considerablemente cuando se usa un kit comercial en combinación con incubación previa a la lisis y purificación posterior a la extracción. Estos ácidos nucleicos se sugieren para uso en potenciales aplicaciones moleculares a posteriori.

Molecular techniques require extractions of nucleic acids in adequate quantity and purity. This work describes a one-factor generalized linear model (GLM) fitted with fixed effects on nucleic acid yield (ng/μl) and purity (A260/A280 and A260/A230), for five DNA extraction methods using cards. FTA with goat blood (Capra aegagrus hircus). Two commercial methods based on silica columns (Invitrogen and Macherey Nagel; MN), chelating resin method (Chelex), CTAB method and the phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI) method were tested. Additionally, for MN, an incubation step with PBS (Phosphate Buffered Saline) buffer at high temperature prior to lysis and a purification step after extraction were evaluated using a two-factor fixed effect model with interaction. DNA concentrations and purity ratios were variable; the highest concentration was obtained with the MN kit (170.45 ng/μl), but with deficiencies in purity (0.32 of A260/A230, 0.34 of A260/A280). Despite this, all extraction methods generated PCR products with specific D-loop (mtDNA) primers. The combined effect of the pre-incubation and post-purification steps yielded satisfactory purity values ​​(1.89 for A260/A230 and 1.65 for A260/A280), as well as concentration ratios (476.78 ng/μl) with low variability. In conclusion, the concentration and purity of DNA from blood samples is considerably improved when a commercial kit is used in combination with pre-lysis incubation and post-extraction purification. These nucleic acids are suggested for use in potential downstream molecular applications.