Identification and Investigation of Autolysin Genes in Clostridium saccharoperbutylacetonicum Strain N1-4 for Enhanced Biobutanol Production

Abstract

Biobutanol is a valuable biochemical and one of the most promising biofuels. Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 is a hyperbutanol-producing strain. However, its strong autolytic behavior leads to poor cell stability, especially during continuous fermentation, thus limiting the applicability of the strain for longterm and industrial-scale processes. In this study, we aimed to evaluate the role of autolysin genes within the C. saccharoperbutylacetonicum genome related to cell autolysis and further develop more stable strains for enhanced butanol production. First, putative autolysin-encoding genes were identified in the strain based on comparison of amino acid sequence with homologous genes in other strains. Then, by overexpressing all these putative autolysin genes individually and characterizing the corresponding recombinant strains, four key genes were pinpointed to be responsible for significant cell autolysis activities. Further, these key genes were deleted using CRISPR-Cas9. Fermentation characterization demonstrated enhanced performance of the resultant mutants. Results from this study reveal valuable insights concerning the role of autolysins for cell stability and solvent production, and they provide an essential reference for developing robust strains for enhanced biofuel and biochemical production.

El biobutanol es un bioquímico valioso y uno de los biocombustibles más prometedores. Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 es una cepa productora de hiperbutanol. Sin embargo, su fuerte comportamiento autolítico conduce a una mala estabilidad celular, especialmente durante la fermentación continua, lo que limita la aplicabilidad de la cepa para procesos a largo plazo y a escala industrial. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar el papel de los genes de autolisina dentro del genoma de C. saccharoperbutylacetonicum relacionado con la autólisis celular y desarrollar más cepas más estables para mejorar la producción de butanol. Primero, los genes que codifican la autolisina putativos se identificaron en la cepa basándose en la comparación de la secuencia de aminoácidos con genes homólogos en otras cepas. Luego, sobreexpresando todos estos genes de autolisina putativos individualmente y caracterizando las cepas recombinantes correspondientes, se identificaron cuatro genes clave como responsables de las actividades de autolisis celular significativas. Además, estos genes clave se eliminaron utilizando CRISPR-Cas9. La caracterización de la fermentación demostró un rendimiento mejorado de los mutantes resultantes. Los resultados de este estudio revelan información valiosa sobre el papel de las autolisinas para la estabilidad celular y la producción de solventes, y proporcionan una referencia esencial para desarrollar cepas robustas para mejorar la producción de biocombustibles y bioquímicos.