Establecimiento e implementación de un protocolo de extracción, aislamiento, cultivo y reimplantación de células madre mesenquimales para el tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos

Abstract

Como respuesta medica alas frecuentes recaídas que presentan los equinos al ser tratados por medio de las terapias tradicionales después de sufrir una lesión de tendón y ligamento que van de un 43% a 93% de los casos (Dahlgren, 2005; Crowe, 2004; Dyson, 2004; Kasashima et al., 2004; Ross & Dyson, 2003; Smith et al., 2003; Stashak, 2002; Becker et al., 1998; Gibson et al., 1997; Dyson, 1991 a, b; Gaughan et al., 1991); nace la necesidad de determinar si en el país es técnica y tecnológicamente factible realizar aislamientos de células madre de origen adiposo (ADSC) con fine~ terapeuticos en el país. El estudio se basa en la capacidad ( comprobada por medio de estudios in vivo) que este tipo de células presentan para regenerar el tejido tendinoso y producir una estructura biomecánicamente funcional. Además de esto las ADSC presentan un efecto antiinflamatorio significativo (Dahlgren, 2005; Nixon & Dahlgren, 2004; Smith et al., 2003; Young et al., 1998). La reparación normal en contraste, produce cicatriz no elástica, que a su vez favorece que se presenten recidivas en las lesiones una vez que el animal se somete a la carga completa de trabajo (Dyson, 2004; Hinchcliff et al., 2004; Ross & Dyson, 2003; Stashak, 2002). La presente tesis consiste en el establecimiento de un protocolo de aislamiento y cultivo de ASDC. Además la implementación de un protocolo de extracción de la muestra de tejido adiposo y reimplantación de las ADSC intralesionalmente en casos clínicos referidos a la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. Por otro lado se trato de identificar a las células aisladas por medio de sus características morfológicas, su comportamiento in vitro e in vivo, tinciones básicas e histoquímicas y su inmunofenotipo. Además se evaluó clínica y ultrasonográficamente los casos tratados para determinar su evolución. Mediante esta investigación se obtuvo un protocolo de aislamiento altamente especifico células morfológicamente muy similares alas ADSC y células madre mesenquimales (MSC) aisladas en otros trabajos, las cuales mantienen su morfología sin importar el medio de cultivo en el que estén, someterse a varios pasajes y congelación, que presentan características morfológicas similares a células primitivas o progenitoras, que son positivas a tinciones histoquímicas que comúnmente tiñen tejidos de origen mesenquimal, que no forman ningún tipo de masa en ratones inmunosupresos similar a lo reportado por Rubio et al., 2005 y que además han producido una mejoría clínica en los casas tratadas (Rubio et al., 2005; Strem et al., 2005; Gimble & Guilak, 2003; Zuk et al., 2002; Zuk et al., 2001). Todos estos hallazgos en conjunto permitieron determinar que las ASDC comparten características importantes con las células aisladas en este estudia, siendo indicativa de que a partir del protocolo que se ha planteada en esta investigación realmente se puede conseguir aislar y cultivar células madre mesenquimales de origen adiposo para fines terapéuticos, en este caso en especifico para tratar lesiones en tendón y ligamento.

As a medical response for the frequent reinjury that is presented in horses when they are treated with the traditional therapies after tendon and ligament lesion that goes from 43% to 93% of the cases (Dahlgren, 2005; Crowe, 2004; Dyson, 2004; Kasashima et al., 2004; Ross & Dyson, 2003; Smith et al., 2003; Stashak, 2002; Becker et al., 1998; Gibson et al., 1997; Dyson, 1991 a, b; Gaughan et al., 1991); the necessity of detennining if in the country is technical and technologically possible to isolate adipose derived stem cells (ADSC) for therapeutic purposes was born. The study is based in the capacity (confin'lled by in viva studies) that this type of cells present for regenerating the tendinous tissue and to produce a biomechanically functional structure. It also was demonstrated that the ADSC present a significant anti-inflammatory effect (Dahlgren, 2005; Nixon & Dahlgren, 2004; Smith et al., 2003; Young et al., 1998). All this in contrast with the nonnal healing of the tendon in which a less elastic S.CM tissue is formed promoting reinjury once the animal is expose to full work (Dyson, 2004; Hinchcliff et al., 2004; Ross & Dyson, 2003; Stashak, 2002). This thesis work consists in the establishment of an isolation and culture protocol for ADSC. Also, the implementation of a protocol for extraction of the adipose tissue and a protocol for the reimplantation of the ADSC intralesionally of the clinical cases referred to the School of Veterinary Medicine, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. The isolated cells where identified by the morphological characteristics, the cell behavior in vivo and in vitro, basical pathological stains and histochemistry and also by the inmunophenotype. Also the treated cases where evaluated clinically and ultrasonographically to follow up the evolution. Summarizing, we obtained, using an isolation protocol highly specific proved by other studies, cells morphologically similar to the ADSC and mesenquimal stem cells (MSC) isolated in other investigations, these cells maintain the aforementioned morphology in different culture mediums, after several passages and post thaw, they also present primitive or progenitor cells characteristics, they are positive to histochemistry stains for mucopolisacarids (normally found in mesenchymal tissue), they doesn't form tumors in inmunosupress mice as reported .by Rubio et al. and they produce clinical improvement in the treated cases (Rubio et al., 2005, Strem et al., 2005, Glmble & Gul1ak, 2003, Zuk et al., 2002, Zuk et al., 2001). All the findings together determine that the ADSC share important characteristics with the cells isolated in this study, being this indicative that by using the established protocol, we can really isolate and culture adipose .derived mesenchymal stem cells for therapeutic purposes, and in these specific case for the treatment of tendon and ligament injuries.