Identificación de cepas de Coronavirus y Rotavirus presentes en muestras fecales diarreicas de bovinos y niños en Costa Rica

Abstract

En el periodo comprendido entre Octubre del 2006 hasta Julio del 2007 se recolectaron 115 muestras de heces diarreicas de ternero y 116 de niño. Utilizando un ensayo inmunocromatográfico comercial 3.5 % de las muestras de bovino fueron positivas a Coronavirus entéricos y 20.6% de las muestras de heces de humano fueron positivas en un DOT-ELISA estandarizado en el laboratorio. Mediante la técnica de (RT)-PCR, 23 muestras de ambas especies fueron probadas y se obtuvieron amplificaciones compatibles con las esperadas para una sección del gen pol de los Coronavirus en 2 (1.7%) muestras de origen humano y 3 (2.6%) de origen bovino. Una de las muestras de origen bovino mostró amplificación con los dos juegos de cebadores utilizados para diferenciar entre los linajes específicos de los Coronavirus, las otras cuatro mostraron amplificación con el juego de iniciadores específicos para el grupo II. Posteriormente se realizó cultivo celular de las muestras positivas el PCR en la línea celular HRT-18. Después del tercer pasaje, se observó un efecto citopático leve en algunas muestras. A continuación, se llevó a cabo un ensayo de inmunofluorescencia utilizando un conjugado anti-BCV-fluoresceína. Dos muestras de humano mostraron fluorescencia específica en algunas de las células de la monocapa probablemente resultante de la reacción antigénica cruzada con el conjugado anti-BCV. Las 5 muestras son buenas candidatas para la secuenciación y futuros estudios filogenéticos. Por otro lado, las mismas muestras de heces de niños (n=116) fueron utilizadas para la caracterización del genotipo de las dos proteínas externas de cápside VP7 y VP4 de Rotavirus A y la determinación del patrón de migración electroforético del genoma viral. En 34.5% de las muestras positivas al SDS-PAGE, se determinó el patrón corto (n= 2) y largo (n=38). Así mismo, el genotipo predominantemente encontrado fue GNTP[8](34.0%) y por primera vez en Costa Rica se determinaron las combinaciones inusuales G3P[4](2.5%) y G10P[8] (10.5%), así como las infecciones mixtas G3+10 P[4] (2.5%), G3+10 P[4+8](2.5%), G1+10 P[8] (2.5%) y G1+10 P[8] (2.5%) lo cual sugiere variaciones en los patrones de genotipos de Rotavirus respecto a los resultados de años recientes. La vigilancia de las cepas de Rotavirus circulantes en una región o país es una herramienta importante para determinar si las cepas prevalentes localmente están cubiertas por los antígenos disponibles en las actuales vacunas. Además, la caracterización molecular de Rotavirus y Coronavirus puede proveer nuevos acercamientos a la comprensión de los procesos de transmisión entre especies y a la incorporación de genes virales de origen humano y animal en nuevos patógenos.

Diarrheic stool samples from calves (n= 115) and children (n=116) were recollected during the period between October, 2006 and July, 2007. Using a commercial inmunocromatographic assay, 3.5 % of bovine samples were positive to enteric Coronavirus and 20.6 % of human samples were positive to in-house DOTELISA. Samples from both species (n= 23) were used for molecular characterization through (RT)-PCR. Coronavirus-like PCR amplification was detected in 2 human (1.7%) and 3 bovine (2.6%) samples. One bovine sample showed amplification with two set of primers, each one provides Coronavirus specific-group amplification. The other 4 samples showed amplification only with group II specific primer set. Then, HRT-18 culture isolation was performed for PCR positive samples. After third passage, weak citopatic effect was identified in 2.5% of the samples. After that, direct fluorescent-antibody test was performed using anti-BCV-fluorescein conjugate. Two human samples showed fluorescence in few cells from monolayer; probably result of cross antigenic reaction with anti-BCV conjugate. All 5 samples are good candidates for gene sequencing and future phylogenetic studies. Some children diarrheic stool samples (n=116) were available for Group A Rotavirus characterization by genotype of the two outer capsid proteins, VP7 and VP4. ARN migration pattern (electroferotype) was also determined. Short (n= 2) and long (n=38) e-types were determined in 34.5% samples positive to SDS-PAGE. The predominant genotype was GNTP[8] (34.0%). For the first time in Costa Rica, G3P[4](2.5%) and G10P[8] (10.5%) unusual combination, as well as, G3+10 P[4] (2.5%) and G3+10 P[4+8](2.5%) mixed infection were reported, suggesting recient changing patterns of Rotavirus genotypes. Rotavirus local strains surveillance is an invaluable tool to determinate whether the prevalent strains are covered by the antigens found in current vaccines. Futhermore, molecular characterization of both, Rotavirus and Coronavirus, can provide new approaches to the understanding of interspecies transmission and human-animal viral reassortment process.