Isolation and partial purification of a hemolytic sphingomyelin-inhibitable fraction from the sea anemone Anthopleura nigrescens

Abstract

Actinoporins are highly hemolytic pore-forming proteins with a molecular mass of around 20 kDa and high affinity for sphingomyelin-containing membranes. On the crude extract of the sea anemone Anthopleura nigrescens, the hemolytic activity (HA) was detected. In order to identify the presence of pore-forming proteins similar to actinoporins in this anemone, the fractionation and analysis of its crude extract was carried out. The aqueous extract of the whole body was subjected to gel filtration chromatography on Sephadex G50 medium rendering three resolved peaks (P-I, P-II, and P-III) as measured by their absorbance at 280 nm. Functional characterization of the crude extract and chromatographic fractions was evaluated by HA against human red blood cells. The crude extract and two peaks (P-II and P-III) showed HA. Interestingly, the HA of the crude extract and P-II were specifically inhibited by small unilamellar vesicles of phosphatidylcholine: sphingomyelin (1:1). Both the crude extract and P-II revealed the existence of at least one protein band around 20 kDa by SDS-PAGE. The inhibition by sphingomyelin of the whole body extract HA and the localization of this property in P-II that could be associated with a protein of around 20 kDa suggest the presence of at least one novel actinoporin in A. nigrescens. Furthermore, this is the first report of a biochemical activity for this sea anemone. Work is in progress in order to purify and characterize the molecular entities responsible for this HA inhibited by sphingomyelin.

Las actinoporinas son proteínas formadoras de poros altamente hemolíticas con una masa molecular de alrededor de 20 kDa y alta afinidad por las membranas que contienen esfingomielina. Sobre el extracto crudo de la anémona de mar Anthopleura nigrescens, se detectó la actividad hemolítica (HA). Para identificar la presencia de proteínas formadoras de poros similares a las actinoporinas en esta anémona, se realizó el fraccionamiento y análisis de su extracto crudo. El extracto acuoso de todo el cuerpo se sometió a cromatografía de filtración en gel en medio Sephadex G50 dando tres picos resueltos (P-I, P-II y P-III) medidos por su absorbancia a 280 nm. La caracterización funcional del extracto crudo y las fracciones cromatográficas se evaluó mediante HA frente a glóbulos rojos humanos. El extracto crudo y dos picos (P-II y P-III) mostraron HA. Curiosamente, el HA del extracto crudo y P-II fueron inhibidos específicamente por pequeñas vesículas unilaminares de fosfatidilcolina: esfingomielina (1: 1). Tanto el extracto crudo como el P-II revelaron la existencia de al menos una banda de proteína alrededor de 20 kDa por SDS-PAGE. La inhibición por esfingomielina del extracto de HA de todo el cuerpo y la localización de esta propiedad en P-II que podría estar asociada con una proteína de alrededor de 20 kDa sugieren la presencia de al menos una actinoporina nueva en A. nigrescens. Además, este es el primer informe de una actividad bioquímica de esta anémona de mar. Se está trabajando para purificar y caracterizar las entidades moleculares responsables de este HA inhibido por la esfingomielina.